污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查 RT-PCR法.docx

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1、ICS07.080CCSB40T/GXAS标准TGXASXXXX-XXXX污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法DetectionoffporeinebIueeardiseasevirusinwastewaterRT-PCR（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布本文件参照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西农业职业技术大学提出并宣贯。本文件由广西标准化协

2、会归口。本文件起草单位：南宁壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份有限公司、金陵农牧集团有限公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基智农时代股份有限公司、济凡生物科技（常州）有限公司、广西农业职业技术大学。本文件主要起草人：。污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法1范围本文件描述了污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的方法。本文件适用于污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版木（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术

3、语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1猪蓝耳病porcinebIueeardisease猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪传染病，主要病症表现为母猪流产、仔猪发病死亡和不同年龄猪呼吸障碍等。富集浓缩试剂enrichmentandconcentrationreagent采用聚乙二醇（PEG）离心沉淀法，用于对大体积生活污水或其他水体样本中病原体的核酸片段进行浓缩富集。使用本试剂盒提取的病毒DNA/RNA可适用于各种常规操作，包括PCR,RT-PCR,qPCR和qRT-PCR等实验。病毒富集浓缩virusenrichmentandconcentration将污水样品混合均匀，经离心并弃除离心管中

4、的上清液,将磷酸盐缓冲液加入至离心管中，反复吹吸沉淀，最终形成污水病毒的混悬液（该水样的浓缩液）。瞬时水样instantaneouswatersampIe采样点位某一时间随机采集的样本。混合水样mixedwaterSamP1e同一采样点位不同时间所采集的瞬时水样混合后的样本。Ct值cyc1ethresho1d在实时荧光定量PCR中，每个反应体系中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理向污水中加入富集浓缩试剂，富集浓缩试剂可使病毒颗粒形成多聚体，通过离心作用将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，采用核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。5试剂和材料除另有说明外，所用

5、试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为GB/T6682规定的一级水。1.1 磷酸盐缓冲液：1mo11PBS,PH值7.2。1.2 富集浓缩试剂。1.3 病毒核酸提取试剂盒。1.4 无核酸酶水：分子生物学级。5. 5离心管，1.5m1、50In1o5.1 无菌移液器吸头：10H1、20011m1,带滤芯，无核酸酶。5.2 无菌聚乙烯瓶。5.3 透明薄壁PCR管:0.2m1。6仪器设备5.4 冰箱（OC20C）5.5 子天平：精度0.01g。5.6 速台式冷冻离心机：可控温至-4,离心速度213000g。6. 4低速离心机：离心速度12000r/min。6.1 金属水浴锅。6.2 振荡混匀器。6.

6、3 高压灭菌器。6.4 实时荧光PCR扩增仪。6.5 二级生物安全柜。7样品采集及前处理6.6 样采集、运送和保存6.6.1 据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置，对未经消杀处的污水进行采样。6.6.2 据现场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样或混合水样。6.6.3 无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为20Om1300m1。6.6.4 本采集后，应在现场使用75%酒精对采样瓶外表面进行消毒，并及时将样本送至实验室，运输过程中水样温度保持在OC40Co6.6.5 验室接到水样后应尽快进行检测，如未及时检测，应将水样置于-4冰箱保存待检。6.7 毒富集浓

7、缩7. 2.1将污水样品混合均匀，取同一厂各3管40m1的污水分别置于3个50m1离心管中，在-4C、2500r/min的条件下离心30min。剩余污水样本作为备份。7. 2.2将7.2.1中所得上清液分别转移至试剂盒提供的预混试剂离心管中，充分混合,震荡摇匀30min7. 2.3在-4C、12OOOr/min的条件下离心12Omirb离心机降速时不应使用制动力。将离心管从离心机上取出，倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液倒出。注：该过程需减少沉淀的溶解与损失，以提高病毒浓缩富集效率。7. 2.4在-4、12OOOrAnin的条件下离心5min,离心机降速时不应使用制动力。将离心管从离心机上

8、取下，用移液器从每个离心管中吸出剩余的上清液。注：请勿将吸管尖端接触沉淀。7. 2.5将200U1磷酸盐缓冲液（5.1）加入至离心管中，反复吹吸沉淀，最终形成混悬液（该水样的浓缩液），同一厂3管污水悬混液合为1管浓缩液。7. 2.6将浓缩液转移至1.5m1离心管中,于0C4条件下保存,并于24h内完成核酸提取和扩增。1.2 荧光RT-PCR检测8.1 核酸提取在二级生物安全柜中打开装有污水样本浓缩液的离心管，按照病毒核酸提取试剂盒说明，取适量浓缩液进行核酸提取，提取完成后应立即封盖并进行实时荧光RT-PCR检测。剩余的浓缩液和核酸样本应于-4条件下冻存。8.2 核酸扩增参照猪繁殖与呼吸系统综合

9、征（蓝耳病）荧光PCR检测试剂盒说明书进行。每个样本设置3个平行。9结果评价9.1 阳性结果评价9.1.1 阳性对照FAM通道与V1C通道Ct值均V35且出现特异性扩增曲线。阴性对照应无Ct值，且无特昇性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。9.1.2 FAM通道Ct值W38且出现特异性扩增曲线，判定为病毒核酸阳性。9.1.3 FAM通道Ct值38VCtW45,判定为可疑，应对样本进行复测，若复测结果Ct值仍在3845之间有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。9.2 阴性结果评价9.2.1通道无Ct值或无典型S型扩增曲线，同时V1C通道CT值V38,判为阴性，表明样品中未检出病毒核酸。9.2.2FAM通道无Ct值或无典型S型扩增曲线，同时VIC通道CT值38或无CT值，则该样本检测结果无效，应重新安排采样检测。10检出限猪蓝耳病病毒的方法检出限为1copies/m1o