新冠核酸检测扩增检测操作规程(达安红盒).docx

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1、SOP 18-35新型冠状病毒2019-CoV基因（达安红盒）扩增检测操作规程1 .名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）2 .目的规范新型冠状病毒（2019-nCoV） RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。3 .方法TaqMan探针实时荧光定性。4 .检测原理基于一步法RT-PCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV） ORFlab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORFlab探针采用V1C标记）用于标本中2019新型冠状病毒RA的检测；同时包括内源性内标检测系统（内标基因探针采用C

2、y5标记），用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。5 .样品咽拭子、痰液等6 .试剂中山大学达安基因股份有限公司组分名称规格数量主要成分PCR检测试剂（大包装，96人份/盒）2019-nCoV PCR 反应液 A918PL/管2特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液2019-nCoV PCR 反应液 B204L管2热启动Taq抗体酶、Taq酶、C-NfMLV 酶、dNTPs、UDG 酶、RNasin2019-nCoV阴性质控品450ML/2含2019-nCoV内标片段（RNase P基因）的假病毒、TENC（ORFlab）阳性质控品400ul管2含

3、2019-nCoV目的片段的假病毒、含2019-nCoV内标片段（RNase P基因）的假病毒、TE7.仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8 .操作步骤9 . 1 PCR试剂准备（I区）8. 1. 1从试剂盒中取出2019-nCoV PCR反应液A、2019-nCoV PCR反应液B ，室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。8. 1.2取N个（N=待测样本个数+NC（0RFlabN）阴性质控品+NC（0RFlabN）阳性质控品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR

4、反应液的PCR管置I区区传递窗。NC单人份扩增体系配制如下表:2019-nCoV PCR 反应液 A2019-nCoV PCR 反应液 B扩增体系17ul3ul20ul8. 1.3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 2核酸模板提取（II区）核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。8. 3加样（H区）在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控

5、品各5ul,盖紧管盖，6,000rpm离心数秒后，置区I区传递窗。标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mgL含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台而，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 4PCR扩增检测（I区）8 . 4. 1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。9 . 4. 2循环参数设定：序号步骤温度时间循环数1反转录反应502分钟循环1次2预变性952分钟循环1次3变性955秒循环10次退火、延伸6035秒4变性955秒循环32次退火、延伸及检测荧光6035

6、秒8. 4. 3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。10 结果分析选择定性分析模式，自动调整阈值，必要时可手工设定，以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整。11 .质控标准10. 1 2019-nCoV阴性质控品：FAM和V1C检测通道无Ct值或无明显扩增曲线，Cy5 通道 CtW25；10.2 2019-nCoV阳性质控品:FAM和VTC检测通道Ct值22；10.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。10.4 每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质

7、控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。11.结果判断FAM 通道（green）N基因VIC 通道(yellow)ORFlab基因Cy5 通道（Red）内标（RNase P基因）结果判定Ct 值30或无Ct值Ct 值30或无Ct值Ct 值W30阴性Ct 值30Ct 值W30有或无扩增曲线阳性Ct 值30Ct 值30或无Ct值有或无扩增曲线复检：内标Ct值30或无扩增曲线样本需重新取样检测；内标Cl值30样本可对已提取

8、核酸重新检测或重新取样检测Ct 值30或无Ct值Ct 值W30有或无扩增曲线Ct 值30或无Ct值Ct 值30或无Ct值Ct 值30或无扩增曲线复检结果判读如下：（1）、FAM通道或VIC通道复检结果阳性（Ct值W30）, Cy5通道为阳性（Ct值W30）,可判样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性；（2）、FAM通道和V1C通道复检均为阴性（Ct值30,或无Ct值），Cy5通道为阳性（Ct值W30）,可判样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性；（3）、FAM通道、VIC和Cy5通道复检均为阴性（Ct值30,或无Ct值），需再次重新取样进行检测。【阳性判断值】根据临床样本检测结果，利用R0

9、C曲线法最终确定本试剂盒的目标基因N和0RFlab阳性判断值为30,内标基因RNaseP阳性判断值为30。【检验结果的解释】（1）、每次实验均需检测阴性质控品，阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定；（2）、FAM和VIC检测通道为阳性时，由于体系的竞争关系，Cy5通道（内标通道）结果可能为阴性;(3)、报告建议采用以下格式：阴性结果报告格式为：新型冠状病毒2019-nCoV RNA阴性；阳性结果报告格式为：新型冠状病毒2019-nCoV RNA阳性。【检测方法的局限性】(1)、性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差；技术本身存

10、在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。(2)、样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关，不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果；(3)、样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；(4)、病毒在流行过程中的基因突变则可能导致假阴性结果；(5)、试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。12 .性能指标(厂家提供)12.1 本试剂盒的分析灵敏度为500copies/mL；检测国家灵敏度参考品S,符合要求。12.2 交叉反应：与新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体(如甲型流感病毒(

11、MINI、H1N1 (2009). H3N2、H5N1 H7N9),乙型流感病毒(BYamagata B/Victoria),副流感病毒(I型、II型、IH型)，呼吸道合胞病毒(A型、B型)，鼻病毒A,鼻病毒B,鼻病毒C,腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、7型、55型)，肠道病毒(A型、B型、C型、D型)，人偏肺病毒，EB病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘一带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒(NL6

12、3, 0C43, HKU1, 229E), SARS冠状病毒和MERS冠状病)以及人基因组DNA无交叉反应。12.3 外源性干扰物质：样本中存在新型冠状病毒的治疗药物，如苯福林(100gL)羟甲喋咻(100 gmL)氯化钠(0. 9%)、倍氯美松(100 u gmL)地塞米松(100 gmL)氟尼缩松(100 gmL)曲安奈德(100 gmL)布地奈德(100 gmL)莫米松(100gmL),氟替卡松(100gmL).盐酸组胺(100gmL).干扰素(300UmL)扎那米韦(100gmL)x利巴韦林(100gmL)奥司他韦(lOOug/niL)、帕拉米韦(100 gmL) 洛匹那韦(lOOug

13、/mL)、莫匹罗星(100 gmL) 左氟沙星(100 gmL)s阿奇霉素(100gmL)妥布霉素(1素P g/mL)、利托那韦(100gmL)美罗培南(100ugmL)、阿比多尔(100gmL)头狗曲松(100gmL)对试剂盒的检测结果无干扰。12.4 4咽拭子和痰液样本中可能存在的内源性物质如全血（10%）和粘液（20ugmL）对试剂盒的检测结果无干扰。12.5 精密度：强阳性样本批内/批间精密度，日内/日间精密度，不同操作者之间的精密度变异系数均不大于5%；检测国家参考品R精密度变异系数小于5%o12.6 6阳性参考品符合率：5份企业阳性参考品符合率均为100%；检测国家参考品P1-P7

14、,符合要求。12.7 阴性参考品符合率：10份企业阴性参考品的符合率均为100机检测国家参考品N1-N22为阴性。12.8 临床评价：在3家临床机构完成604例样本的临床试验，与已上市的同类试剂相比:阳性符合率为97. 64%,阴性符合率为99.7K,总符合率为98.84%。13 .生物参考区间阴性。14 .干扰反应（或污染源）15 . 1样本之间污染。14 . 2试剂、耗材（如Tip头）、设备（移液器、离心机、扩增仪等）污染。15 . 3产物及其他质粒污染。16 .安全防护措施具体请参见新冠核酸检测质量与安全管理手册、生物安全管理手册。17 .临床意义体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、痰液样本中、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORFlab和N基因。该检测可用于2019年12月以来，新型冠状病毒（2019-nCoV）感染的肺炎疫情期间，相关病例的辅助诊断和此次疫情的体外诊断应急储备。18 .相关文件18.1 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）产品说明书。17. 2全国临床检验操作规程（第4版）。