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1、糖原磷酸化酶b(G1ycogenphosphory1aseb1GPb)试剂盒说明书微法100管/48样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义:糖原磷酸化酶(GIyCOgenphosphory1ase,GP,EC2.4.1.1)是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开-1,4.糖苜键移去葡萄糖基,释放磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子1,6-糖背键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化前a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺甘酸(51-AMP)存在下可被激活。渊定原理:GP催化糖原和无机磷产生前萄糖残基生成糖原和I
2、-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH,在34Onm下测定NADPH上升速率,即可反映GP活性。添加一定浓度的腺甘酸(5-AMP)时测定GP(GPa和GPb)活性,未添加腺甘酸(5-AMP)时测定GPa活性,GP活性一GPa活性得到GPb活性。需自备的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制:提取液:10Om1X1瓶,4保存;试剂一:液体16m1x1瓶,4C保存;试剂二:粉剂X1瓶,20保存;试剂三:粉剂X1支,209保存;试剂四:粉剂X1支,-20*C保存:
3、试剂五:粉剂X1支,-20C保存:样本的前处理:按照组织质量(g):提取液体积(m1)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入Im1提取液),进行冰浴匀浆。8000g4C离心IOmin,取上清,置冰上待测。渊定步骤:1、分光光度计或函标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸储水调零:2、工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用:用不完的试剂分装后20C保存,禁止反复冻融。3、试剂三的配制:临用前在试剂三瓶中加入Im1蒸储水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20保存,禁止反复冻融。4、试剂四的配制:临用前在试剂四瓶中加入Im1蒸偏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-
4、20C保存,禁止反复冻融。5、试剂五的配制:临用前在试剂五管中加入500U1蒸储水充分溶解待用:用不完的试剂分装后-20C保6、存,禁止反复冻融。7、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37C预热5分钟;8、在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本、101试剂三、101试剂四、IOU1蒸谣水和160U1工作液,立即混匀,记录34Onm处5min后的A1和Iomin后的吸光值A2,计算AAGPa=A2-A19、在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本、101试剂三、101试剂四、IOu1试剂五和160U1工作液,立即混匀,记录34Onm处5min后的A3和IOmin后的吸光值A4,计算AAG
5、P=A4-A30注意;由于每个样本需要同时测一个GP(GPa和GPb)活性和一个GPa活性,因此本试剂盒100管测48个样本。GPb活性计*a.用微石英比色皿测定的计算公式如下:(1)按样本蛋白浓度计算单位定义:每mg组织蛋白每分钟产生Inmo1NADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmo1minmgprot)=(AGP-AGPa)VJ(d)109(V样XCPr)T=643(AGP-AGPa)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义:每g组织每分钟产生Inmo1NADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmo1/min/g鲜重)=(AAGP-AAGPa)XV反总(d)109(WXV样V样总)T=64
6、3x(AAGP-AGPa)WV反总:反应体系总体积,210-41;:NADPH摩尔消光系数,6.221031/mo1/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01m1;V样总:加入提取液体积,1m1;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/m1:W:样本质量,gob.用96孔板渊定的计算公式如下:(1)按样本蛋白浓度计算单位定义:每mg组织蛋白每分钟产生Inmo1NADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmo1/min/mgprot)=(AGP-AGPa)V反总(d)109(V样XCPr)T=1286(AGP-AGPa)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义:每g组织每分钟产生Inmo1NADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmo1/min/g鲜重)=(AAGP-AAGPa)XV反总(d)x1()9(WxV样V样总)T=1286x(AAGP-AGPa)WV反总:反应体系总体积,21041;:NADPH摩尔消光系数,6.221031Zmo1/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01m1;V样总:加入提取液体积,1m1;T:反应时间,5min:Cpr:样本蛋白质浓度,mg/m1:W:样本质量,go