还原型抗坏血酸ascorbicacidAsA含量测定试剂盒说明书.docx

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1、还原型抗坏血酸（ascorbicacid,AsA）含测定试剂盒说明书微法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：ASA又称维生素C。ASA是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，ASA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。渊定原理：在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰班-2-羟基丁酰内酯衍生物，在最大吸收波长420处测定吸光度。自备仪器和用品：研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸储水

2、。试剂组成和配制：提取液：液体IOom1X1瓶，4*C保存。试剂一：液体4m1x1瓶，4七保存。试剂二：液体6m1x1瓶，4C保存。试剂三：粉剂x2瓶（棕色），4避光保存。临用前配制，每瓶加入7m1蒸储水充分溶解，用不完的试剂4下可保存3天。样品中ASA提取：1 .组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入Im1提取液）进行冰浴匀浆。8000g,4C离心20min,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO。个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入Im1提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声

3、3秒，间隔7秒，总时间3min）：8000g,4X2离心20min,取上清液置冰上混匀待测。3 .血清等液体：直接测定。ASA涌定操作：1.分光光度计/幅标仪预热30min,调节波长到420nm,蒸储水调零。2.在EP管中加入下列试剂试剂名称（1）测定管空白管样本I(X)提取液100试剂一3030试剂二5050试剂三120120水700700混匀，25C静置20min,吸取2001加入微量石英比色皿/96孔板中，42Onm下测定各管吸光值。AA=A测定-A空白。注意：标准管只需测定一次。AsA含量计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线y=0.0088x-0.018,R2=0

4、.9978(1) .按蛋白浓度计算AsA(gmgprot)=(A+0.018)0.88V样(CPrXV样)=113.63(A+0.018)Cpr(2) .按样本质量计算AsA(gg鲜重)=(A+0.018)V).0088xV样WxV样V样总)=113.63(A+0.018)W(3) .按细胞数量计算AsA(g104ce11)=(A+0.018)0.(X)88V样(细胞数量XV样V样总)=113.63(AA+0.()18)细胞数量(4)按液体体积计算AsA(gm1)=(A+O.O18).OO88=113.63(A+0.018)V样：加入样品体积，0.1m1：V样总：加入提取液体积，1.0m1;C

5、pr：上清液蛋白质浓度，mg/m1；W：样品质量(g)b.使用96孔板测定的计算公式如下标准曲线y=0.0044x-0.018,R2=0.9978(1) .按蛋白浓度计算AsA(gmgprot)=(A+0.018)0.0()44V样(CprV样)=227.27(A+0.018)Cpr(2) .按样本质量计算AsA(gg鲜重)=(A+0.018)0.0044xV样NWxV样V样总)=227.27(A+0.018)W(3) .按细胞数量计算AsA(g104ce11)=(A+0.018)0.(X)44V样(细胞数量XV样V样总)=227.27(AA+0.018)细胞数量(4)按液体体积计算AsA(gm1)=(A+0.018).0044=227.27(A+0.018)V样：加入样品体积，0.1m1：V样总：加入提取液体积，1Om1;Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/m1：W：样品质量(g)o注意事项：试剂三现配现用，配制好的4C保存，3天内使用完。