表格模板-基因工程II外源基因的表达621 精品.ppt

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1、生物技术概论生物技术概论 基因工程 II外源基因的表达外源基因的表达 概念概念 基因表达：基因表达：生物在代谢活动和生长发育过程生物在代谢活动和生长发育过程中将蕴藏在中将蕴藏在DNA的遗传信息传递到的遗传信息传递到RNA分子，然分子，然后再转移到蛋白质分子的过程，即基因表达。后再转移到蛋白质分子的过程，即基因表达。 基因表达系统基因表达系统原核表达系统真核表达系统大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统酵母表达系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统蓝藻表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统植物细胞表达系统植物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细

2、胞表达系统（一）（一） 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达 授课内容 （二）（二） 外源基因在酵母菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达 （三）三） 外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达 参 考 书1 1、分子克隆实验指南、分子克隆实验指南 J J萨姆布鲁克，主编金冬雁，萨姆布鲁克，主编金冬雁， 黎黎 孟枫，译科学出版社孟枫，译科学出版社. .2 2、基因工程、基因工程 楼士林，杨盛昌，龙敏南，等，主编楼士林，杨盛昌，龙敏南，等，主编. . 科学出科学出 版社版社. . 3 3、基因工程原理、基因工程原理 吴耐虎，主编吴耐虎，主编. . 科学出版社科学出版

3、社. .（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 1 大肠杆菌受体细胞的特征大肠杆菌受体细胞的特征 2 外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理 3 工程菌的构建策略工程菌的构建策略 4 遗传不稳定性及其对策遗传不稳定性及其对策 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达表达外源基因的优势表达外源基因的优势 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 全基因组测序全基因组测序 基因克隆

4、表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达劣劣 势势 缺乏蛋白质的复性功能缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白内源性蛋白酶降解异源蛋白胞内含多种内毒素胞内含多种内毒素 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理 启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外

5、源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理 启动子启动子 定义：定义：位于结构基因上游的一段与位于结构基因上游的一段与 DNA 依赖的依赖的 RNA聚合酶相结合的聚合酶相结合的DNA序列，用序列，用P代表。代表。 大小：大小：为为20300bp。功能：功能：转录目标基因的转录目标基因的mRNAmRNA分类：分类：组成型、调控型组成型、调控型意义：意义：在转录水平控制基因表达在转录水平控制基因表达。 启动子启动子 启动子启动子 -35 -35 区序列区序列 -10 -10 区序列区序列 PL T T G A C A G A T A C T PrecA T T G A

6、T A T A T A A T Ptra A T A G A C A T A AT G T Ptrp T T G A C A T T A A C T Plac T T T A C A T A T A A T Ptac T T G A C A T A T A A T 乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 终止子终止子 转录过头对外源基因表达的影响转录过头对外源基因表达的影响耗时耗时耗能耗能干扰复制，导致质粒的不稳定性干扰复制，导致质粒的不稳定性不能形成理想的二级结构不能形成理想的二级结构（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一

7、）外源基因在大肠杆菌中的表达 核糖体结合位点核糖体结合位点 定义：定义：位于启动子下游，从转录起始点开始位于启动子下游，从转录起始点开始 延伸几十个碱基长度的一段序列。延伸几十个碱基长度的一段序列。 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 核糖体结合位点核糖体结合位点结构：结构： SD序列（序列（Shine-Dalgarno序列）序列） 翻译起始密码子翻译起始密码子 SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区基因编码区5 端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因

8、在大肠杆菌中的表达 核糖体结合位点核糖体结合位点 SD序列（序列（Shine-Dalgarno序列）：序列）： 指位指位于翻译起始密码子上游的于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3 。 它通过与它通过与rRNA 16S亚基亚基3 AUUCCUCC 5 端互补，并专一性结将端互补，并专一性结将mRNA定位于核糖体上，定位于核糖体上，从而启动翻译。从而启动翻译。对外源基因表达的影响：对外源基因表达的影响： （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 SD序列与起始密码子之间的序列：序列与起始密码子之间的序列： 核糖体结合位点核糖体结合位点

9、 对外源基因表达的影响：对外源基因表达的影响： SD序列与起始密码子之间的距离：序列与起始密码子之间的距离：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 翻译起始密码子：翻译起始密码子： 位于核糖体结合位位于核糖体结合位点的中心位置。点的中心位置。 大肠杆菌翻译起始密码子：大肠杆菌翻译起始密码子： AUG、GUG或或UUG。 核糖体结合位点核糖体结合位点 对外源基因表达的影响：对外源基因表达的影响： （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：密码子偏爱性对外源基因表达的影响： 密码子密码子密码子偏爱性：密码子偏爱性：

10、 外源基因全合成外源基因全合成 同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因 策策 略略（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式 定义：定义：大肠杆菌在表达

11、一些异源基因时，在大肠杆菌在表达一些异源基因时，在某些生长条件下，能将这些生物大分子致密地集某些生长条件下，能将这些生物大分子致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，而聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，而不溶于水，这种结构称为包涵体（不溶于水，这种结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。）。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 组成：组成：外源基因表达产物、外膜蛋白、外源基因表达产物、外膜蛋白、载体蛋白及少量的载体蛋白及少量的DNA、RNA和脂多糖等非和脂多糖等非蛋白分子。蛋白分子。 重组蛋白的性质：重组蛋白

12、的性质：具有正确的氨基酸序具有正确的氨基酸序列，但构象错误。列，但构象错误。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达优点：优点： 简化表达产物的分离操作简化表达产物的分离操作 保持表达产物的结构稳定保持表达产物的结构稳定缺点：缺点： 重组蛋白丧失了原有的生物活性重组蛋白丧失了原有的生物活性 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键主要任务：拆开错配的二硫键和次级键 包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性 ： （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆

13、菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 试剂和条件试剂和条件： 溶解与变性溶解与变性 ： 清洗剂清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸、正十二醇肌氨酸 促溶剂促溶剂 盐酸胍、尿素盐酸胍、尿素 混合溶剂混合溶剂 极端极端pH （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 主要任务：主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 复性与重折叠复性与重折叠 ： （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 复复 性：性： 复性与

14、重折叠复性与重折叠 ： 分段稀释法分段稀释法 一步稀释法一步稀释法 试剂添加法试剂添加法 蛋白修饰法蛋白修饰法 产物隔离法产物隔离法 分子伴侣法分子伴侣法 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型表达包涵体型表达 二硫键形成二硫键形成复性与重折叠复性与重折叠 ： 化学氧化法化学氧化法 二硫键交换法二硫键交换法 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达化学氧化法化学氧化法二硫键交换法二硫键交换法 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 分泌型表达分泌型表达外源基因的表达形式外源基因的表达形式 定义：定义：外源基因

15、的表达产物通过运输或分泌外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基中。的方式穿过细胞外膜进入培养基中。 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 分泌型表达分泌型表达优点：优点： 目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 有利于目的蛋白形成正确的空间构象有利于目的蛋白形成正确的空间构象 缺点：缺点： 表达量低表达量低 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 分泌型表达分泌型表达系统的构建系统的构建 ： 在目的基因在目的基因N端加入大肠杆菌端加入大肠杆菌信号肽信号肽序列

16、序列，转化完全分泌型受体细胞。，转化完全分泌型受体细胞。 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 融合型表达融合型表达外源基因的表达形式外源基因的表达形式 定义：定义：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框，基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框，以目的蛋白和受体菌蛋白融合形式表达目的蛋以目的蛋白和受体菌蛋白融合形式表达目的蛋白。白。 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 融合型表达融合型表达优点：优点： 目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高 目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好 缺点：缺点： 裂解和进一步分离裂解和进一步分离 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 融合型表达融合型表达构建原则：构建原则： 高效表达高效表达 外源基因的位置外源基因的位置 两个结构基因拼接位点处序列的设计两个结构基因拼接位点处序列的设计 保持一致的翻译阅读框架保持一致的翻译阅读框架 （一）外源基因在大肠杆菌