安儿宁颗粒的体外抗菌、抗炎和免疫增强活性研究.docx

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1、安儿宁颗粒的体外抗菌、抗炎和免疫增强活性研究刘帆张颖颖侯林R285. 5 文献标志码 A 1001-0408 (2019) 16-2221-05DOI 10. 6039/j. issn. 1001-0408. 2019. 16. 12摘要目的：押价安儿宁颗粒的体外抗菌、抗炎和免疫增强活性。方法：采用微量稀释法检测安儿宁颗粒(1.562 5-100 mg/mL)对10种临床常见致病菌的抑制作用并计算其最低抑菌浓度(MIC)；以1火264.7细胞(单核巨噬细胞)为对象，采用脂多糖(LPS)诱导建立细胞炎症模型，以MTT法考察安儿宁颗粒(0.312 520 mg/mL)对细胞增殖及其释放一氧化氮(N

2、O)的影响；以BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞为对象，以MTT法考察安儿宁颗粒(0.312 520 mg/mL)对细胞增殖的影响。结果：安儿宁颗粒对表皮葡萄球菌和肺炎链球菌的MIC均为6. 25 mg/mL,对变形杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽苑杆菌和大肠埃希菌(标准菌株)的MIC均为12. 5 mg/mL,对铜绿假单胞菌、粪肠球菌、蜡样芽施杆菌的MIC均为25 mg/mL,对大肠埃希菌（临床分离菌株）、伤寒沙门菌的MIC均为50 mg/mLo与LPS模型组比较，安儿宁颗粒在0.312 5-1.25 mg/mL的剂量下能显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞中N0的释放(P0. 05)；与空白对照

3、组比较，安儿宁颗粒在试验剂量下对RAW 264. 7细胞和小鼠脾脏淋巴细胞增殖无干扰或有促增殖趋势，其在0.625、0.312 5 mg/mL剂量下能显著促进淋巴细胞增殖(P0.05) o结论：安儿宁颗粒在体外对临床常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌均有一定的抑制作用，并具有抗炎和免疫增强作用。Key安儿宁颗粒;抗菌;抗炎；免疫活性Study on in vitro Antibacterial, Anti-inflammatory andImmunopotentiating Activity of An erning GranulesLIU Fanl, 2, ZHANG Yingyingl,

4、HOU Linl, 2 (1. College of Pharmacy,Shandong University of TCM, Jinan 250355, China； 2. Qingdao Academyof Chinese Medical Sciences, Shandong University of TCM, ShandongQingdao 266114, China)ABSTRACT OBJECTIVE： To evaluate the in vitro antibacterial,anti-inflammatory and immunopotentiating activity o

5、f An erninggranules. METHODS： Micro-dilution method was used to determine theminimum inhibitory concentration (MIC) of An erning granules (1.5625-100 mg/mL) on 10 kinds of common pathogenic bacteria. Using RAW264. 7 cells (mono-nuclear macrophage) as objects, LPS was used toreplicate inflamination m

6、odel. MTT assay was used to investigate theeffects of An erning granules (0. 312 5-20 mg/mL) on proliferationand the release of NO of macrophage. Using spleen lymphocyte ofBALB/c mice as objects, MTT assay was used to investigate theeffects of An erning granules (0. 312 5-20 mg/mL) on lymphocyteprol

7、iferation. RESULTS： MIC of An erning granules to Epidermisstaphylococcus and Streptococcus pneumoniae was 6. 25 mg/mL； MIC ofAn erning granules to Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,Bacillus subtilis and Escherichia coli (standard strain) were 12. 5mg/mL； MIC of An erning granules to Pseudomona

8、s aeruginosa,Enterococcus faecalis and Bacillus cereus were 25 mg/mL； MIC ofAn erning granules to E. coli (clinical isolates) and Salmonellatyphia were 50 mg/mL. Compared with LPS model group, An erninggranules could significantly reduce the LPS-induced release of NO inRAW 264.7 cells at the dose of

9、 0.312 51.25 mg/mL (P0.05).Compared with blank control group, An erning granule had nointerference on the proliferation of RAW 264. 7 cells and spleenlymphocytes of mice or had a tendency to promote proliferation. Itcould significantly promote lymphocyte proliferation at doses of0. 625 and 0. 312 5

10、mg/mL (P0.05) . CONCLUSIONS： An, erning granulesnot only have certain in vitro inhibitory effects on clinical commonGram-positive and Gram-negative pathogenic bacteria, but also haveanti-inflammatory and immunization enhancement effects.KEYWORDS An erning granule；Antibacterial；Anti-inflammatory；Immu

11、neactivity呼吸道感染疾病是主要由菌、病毒及少数支原体、衣原体等病原体感染引起的常见疾病，在儿童中发病率最高，而抗菌、抗炎是其主要治疗手段之一1。但化学类抗菌药物在治疗感染性疾病的同时也常常引起患者体内菌群失调，加之其不合理使用导致的耐药性逐年增加2,使得寻找其他安全、有效的药物用于治疗呼吸道感染疾病具有重要的临床意义。扶正祛邪类中药能通过多途径、多靶点发挥作用，在治疗感染性疾病尤其是呼吸道感染方面优势显著3。安儿宁颗粒处方源于藏医经典方“九西更卓”，至今已有300年应用史;该药由天竺黄、人工牛黄、红花、岩白菜、唐古特乌头、高山辣根菜、甘草、洪连和檀香等9味药材组方精制而成，具有清热祛

12、风、止咳化痰的功效，主要用于治疗小儿风热感冒、咽痛发热、咳嗽有痰、上呼吸道感染见上述证候者4。在临床实践中发现，安儿宁颗粒不仅可用于治疗小儿上呼吸道感染，还可用于治疗小儿急性支气管炎、支气管肺炎等下呼吸道感染疾病，对以上疾病引起的发热、咳嗽、咳痰、咽痛等症状也有较好的治疗作用5。药效学研究证实，安儿宁颗粒有较好的镇咳祛痰、解热镇痛、抗炎作用6,且处方中的红花、甘草也已明确具有抗菌、抗炎及增强免疫作用7。为明确安儿宁颗粒抗菌、抗炎和增强免疫的作用，本研究作为“安儿宁颗粒二次开发”课题的一部分，就该颗粒剂对常见呼吸道感染致病菌、脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症反应的抑制作用以及对脾脏细胞增殖的影响

13、进行考察，为该颗粒剂临床用药适应证范围的拓宽、进一步深入开发及应用提供实验依据。1材料1.1 仪器BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平公司）；CKX-31型倒置显微镜（日本Olympus公司）；MK3型酶标仪（芬兰Finnpipette公司）；TD5Z型酶标板离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；LH-SDS型超净工作台（济南隆宏净化设备有限公司）；HF90型C02细胞恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；MJ37600型全自动高压灭菌锅（山东德强仪器有限公司）；DW-86L286型低温储物箱（海尔电器有限公司）；101ATE型电热鼓风干燥箱（上海市试验仪器总厂）；LRH -250A型生化

14、培养箱（广东医疗器械厂）；Vortex3型涡旋振荡器（德国IKA公司）；SZH-82型气浴恒温振荡器（江苏省金坛市城东久久实验仪器厂）。1.2 药品与试剂安儿宁颗粒（批号：02170612）由金诃藏药股份有限公司提供。处方组成：天竺黄66.7 g、人工牛黄5.3 g、甘草53.3 g、洪连66. 7 g、唐古特乌头66. 7g、红花53.3 g、岩白菜53.3 g、高山辣根菜53.3 g、檀香66. 7 go提取及制备工艺：取檀香、红花提取挥发油（另器收集），残渣与天竺黄、甘草、洪连、唐古特乌头、岩白菜、高山辣根菜等6味药材混合，加入10倍量水（mL/g）煎煮2次（分别煎煮3、2 h）,合并煎

15、液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.301.35 （50 ）的稠膏；取稠膏加入人工牛黄和蔗糖（辅料）适量，制粒，干燥;加入檀香、红花挥发油混匀，制成1 000 g,即得。以甘草酸的含量为指标进行成分转移监测，每1 g干浸膏粉相当于安儿宁颗粒13.68 g,相当于生药材6.57 go因辅料蔗糖可导致抗菌试验产生假阳性结果，故本研究以安儿宁颗粒未加蔗糖前的干浸膏粉（即稠膏在鼓风干燥箱中干燥后获得）添加人工牛黄和檀香、红花挥发油制成不含蔗糖的安儿宁颗粒样品，用于后续试验。LPS （美国Sigma公司，批号：S11060）；硫酸庆大霉素注射液（辰欣药业股份有限公司，批准文号：国药准字H37021973,规格：2 mL/支）；2%RPMI 1640细胞维持液赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：61870-036 ；MH （B）肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20151206001）；红细胞裂解液（美国Hyclone公司，批号：00-4333-57）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素、链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）；pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS,无菌级别）、0. 25%胰蛋白酶-EDTA （美国Gibco公司）；二甲基亚飒（DMS0,天津化学试