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1、SARS-CoV-2全基因组T细胞表位作图揭示COVID/9患者的免疫优势和大量CD8+ T细胞活化绘制SARS-CoV-2 T细胞识别图由细胞毒性CD8 + T细胞介导的细胞免疫有助于防止病毒感染，但对SARS-CoV-2 T细胞的全谱识别和先前存在的T细胞免疫的作用仍未完全了解。塞尼等人。使用DNA条形码肽-MHC-I多聚体扫描SARS-CoV-2基因组，以识别C0VID-19患者的CD8 -细胞。在10个分析的HLA分子中，122个独特的SARS-CoV-2 CD8 检测到T细胞表位，包括5个主要集中在0RF1内的免疫显性表位。健康供体表现出对较低亲和力的广泛T细胞识别，并且共享表位可能
2、部分归因于与季节性人类冠状病毒的同源性。与轻度疾病相比，严重疾病期间SARS-CoV-2特异性CD8的频率和活化增加，突出了与疾病进展相关的T细胞反应的差异。抽象的T细胞对于有效清除病毒、消除病毒感染细胞和长期疾病保护很重要。为了检查C0VID-19中CD8 T细胞免疫的全谱，我们通过实验评估了 3141种主要组织相容性复合物（MHC） I类结合肽，覆盖了完整的SARS-CoV-2基因组。使用DNA条形码肽-MHC复合多聚体结合T细胞表型面板，我们报告了 122个免疫原性和免疫显性SARS-CoV-2 T细胞表位子集的完整列表。在C0VID-19患者中观察到大量CD8 -细胞识卧高达27%的c
3、d8 +淋巴细胞与saRS-CoV-2衍生的表位相互作用。大多数免疫原性区域来自开放阅读框1 （0RF1）和0RF3,其中0RF1包含大部分免疫显性表位。在健康供体中也观察到对SARS-CoV-2衍生表位的低亲和力CD8 -细胞识别。这种预先存在的T细胞识别特征与在C0VID-19患者中观察到的表位景观部分重叠，并可能推动T细胞对SARS-CoV-2感染的反应进一步扩大。SARS-CoV-2特异性CD8 +的表型T细胞在C0VID-19患者中显示出强烈的T细胞活化，而在健康个体中观察到最小的T细胞活化。我们发现，与轻度疾病患者相比，重症患者表现出明显更大的SARS-CoV-2特异性T细胞群，并
4、且这些T细胞表现出强大的激活特征。这些结果进一步加深了我们对T细胞对SARS-CoV-2感染的免疫力的理解，并假设强烈的抗原特异性T细胞反应与不同的疾病结果相关。介绍由高度传染性的SARS-CoV-2 （严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2）引起的C0VID-19 （冠状病毒病2019）大流行以前所未有的规模挑战了公共卫生，迄今已导致全球超过200万人死亡(7 )o T细胞在控制和消除病毒感染方面发挥重要作用；CD8 + T细胞对于有效清除病毒感染细胞至关重要，而CD4 , T细胞对于支持CD8 + T细胞反应和B细胞介导的特异性抗体产生都很重要。持续大流行的特征表明，T细胞识别对于介导针对SAR
5、S-CoV-2的长期保护至关重要(2,因为抗体介导的反应似乎在恢复期患者的后续评估中下降，尽管目前尚不清楚这如何影响再感染的风险以及疾病保护所需的抗体水平( 3-5 2。此外，对密切相关的SARS-CoV感染的研究表明，即使在SARS康复患者中11年后没有B细胞反应(6 ,7 CD8 +记忆T细胞在长期记忆中的潜在作用也是如此。对冠状病毒的长期保护。最近的几项研究报告了 SARS-CoV-2感染患者的强大T细胞免疫(8-10 2_一未暴露的健康个体也表现出仅限于SARS-CoV-2的功能性T细胞反应性，9厂11-15人据推测，观察到的T细胞交叉反应源于常规暴露于广泛传播的普通感冒冠状病毒人类冠
6、状病毒(HCoV) (HCoV-0C43、HCoV-HKUK HCoV-NL63 和 HCoV-229E),其中 90%的人群对这些病毒呈血清反应阳性(16 ,互)并且与SARS-CoV-2基因组具有实质性序列同源性(18 , 19_T)。然而，人们对这种预先存在的免疫对与C0VID-19疾病相关的T细胞识别的影响知之甚少。SARS-CoV-2感染可导致轻度至重度疾病（包括死亡），但也描述了大量无症状感染者（四 - 驾）。以交叉反应性T细胞为代表的预先存在的T细胞免疫的存在可能对个体对SARS-CoV-2感染的反应产生重大影响。然而，它们在遇到SARS-CoV-2感染时的生物学作用仍不清楚，它
7、们对疾病保护的贡献需要确定。此外，在严重的临床疾病中，报告了细胞因子释放综合征，在某些情况下，可能会通过免疫抑制药物或抗白细胞介素6 （IL-6）抗体治疗来抑制（义，义）。这种临床特征表明潜在的不受控制的免疫反应与强T细胞活化有关。CD8 + T细胞通过T细胞受体（TCR）与病毒感染细胞表面上主要组织相容性复合物I类（MHC-1）分子呈递的肽抗原之间的特异性相互作用而被激活。尽管在C0VID-19和先前存在的T细胞的背景下都报道了 SARS-CoV-2特异性免疫，但病毒基因组内的全谱精确抗原（最小肽表位）与这种免疫及其在SARS中的免疫优势相关-CoV-2感染的患者，未完全描述。使用我们基于D
8、NA条形码肽-MHC（PMHC）多聚体（25 ）的大规模T细胞检测技术，我们在整个SARS-CoV-2基因组中绘制了 T细胞识别图，确定了 SARS-CoV识别的确切表位-2特定CD8+ T细胞，以及这些表位在C0VID-19疾病中的免疫优势。在未暴露于SARS-CoV-2的健康个体中也发现了对SARS-CoV-2衍生肽的广泛T细胞识别，两组中识别的pMHC复合物有很大重叠。然而，患者组的T细胞识别显着增强，SARS-CoV-2反应性T细胞占所有CD8 + T细胞的27%O此外，我们评估了 SARS-CoV-2特异性T细胞的表型特征，并将其激活特征与疾病严重程度相关联。结果SARS-CoV-2
9、特异性CD8 + T细胞识别广泛的表位为了揭示C0VID-19疾病中T细胞免疫的全谱，我们使用完整的SARS-CoV-2基因组序列（26 ）来识别CD8 + T细胞识别的免疫原性最小表位。使用NetMHCpan4. 1 （红），我们选择了 2204种潜在的人类白细胞抗原（HLA）结合肽（9到11个氨基酸）进行实验评估。预计这些肽会结合10种流行的MHC-I分子中的一种或多种，包括 HLA-A （A01 包1、A02:0K A03:01 和A24:02） 、 HLA-B （B07:02 B08： 01 和 B15:01）和HLA-C （C06:02、C07:01 和 C07:02）基因座,导致总
10、共3141个pMHC特异性用于实验评估（图1A和表Sl）o表位预测覆盖了整个病毒基因组，开放阅读框1 （0RF1）是最大的基因区域，因此包括最多数量的预测肽（图）O分析了 18名C0VID-19患者的T细胞对这些肽的反应性。在这个队列中，H名患者患有需要住院治疗的重症,7名患者患有不需要住院的轻度疾病。在感染的活跃期采集血样，在第一次SARS-CoV-2检测呈阳性后尽可能接近（表S2） o使用10种选定的MHC-I分子可获得的平均HLA覆盖率为每位患者3. 1个HLA,患者平均使用972个DNA条形码pMHC多聚体进行评估（图S1A）（空）。简而言之，每个pMHC复合物在PE （藻红蛋白）标记
11、或APC （别藻蓝蛋白）标记的葡聚糖骨架上多聚化，并用独特的DNA条形码标记。然后将带有DNA条形码的pMHC多聚体汇集在一起，以生成HLA匹配的患者定制pMHC多聚体面板，将其与患者衍生的PBMC （外周血单核细胞）一起孵育，并对与CD8 + T细胞结合的多聚体进行分类和测序以鉴定T细胞对探测到的pMHC复合物的识别。为了进行比较评估，我们还包括了来自常见病毒的39个T细胞表位：巨细胞病毒（CMV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）和流感（flu）病毒（CEF）（图1C和表S3） oOAFlabB40CIhi200 ORF10(221 N(177)ORF8 (57)ORF7 (69)ORF6 (
12、26) M(138) E网，ORF3(1401 S(616) ORF1 (18M)SOSQ9doAoqwnN11U1UU1U魅落修游*0Spike (S)Nudeocdpsid (N)Mtmbrant (M)Envelope (E)SARS-CoV-2 peptides10 MHC class I HLAs3142 peptidesSARS*CoV-2 genome10Q3EM NORF3a ORFIO0RF6ORF7a0F8DNA4arcodedpMHC multimersRespresentative COVID-19 patient (AP0301)SARS-CoV-2 pMHCbarc
13、oded multimers (PE)6O.W slsae popo2片0x2aAll COVID-19 patientsA01:01 A02:01 A03:01Peptides n) (397)(278)(297)Samples n1412-10-8-6-T忤HlA01 01 02 01. 03 01.24 02HLA-a07.02. M 01. 15.01HLAC06 02.07:01. 07:02NetMHCpan 4.1Patient-specific . 135arameter . Parallel analysis PBMCs Sorting of multinwr. Sequen
14、cing andmuKimer panel phenotype panel T cell detection and phenotype CD8, Tdata processingCD3, CD4. COS.CD45RA. CCR7, CO27.COW. CD9. C0U7HLA-OR. PO1. CO57. CD39Peptide-HLA pacA01:011397)B15.01(374)A24:02 BOB 01(3831(261)Proteins CEF okfi s ORF3ORF6ORF 7ORF8 N ORF 1087:01CEFA24:02 807:02 B08:01 815:01 C06:02C07:01 C07:02(383)(209) (261)(374) (291) (295)(356)(4)Hl(6VCEF(39)Peptide-HLA pairsmu.All COVID-19 patients“la la0EONSum of estimated frequencies图1 SARS-CoV-2中的CD8 + T细胞表位图。(A)用于鉴定3141种肽的完整SARS-CoV-2基因组示意图，其中10种流行HLA-A的预测结合等级（NetMHCpan 4.1） 0.5 （ORF1 蛋白）和01 （所有剩余蛋白
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