乌鳢烂身病病原的分离鉴定及病理组织观察.docx

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1、摘要:为探究乌鳗ChannaWTgVS烂身病的病因及患病乌婚的体表组织病理学变化，从广东中山某养殖场患烂身病乌婚病灶处分离到一株优势菌ZS20230317,通过形态学特征、革兰氏染色、16SrRNA及生理生化特性对分离菌株进行鉴定，并检测了该菌株的药物敏感性，最后采用回归感染试验确认分离菌株为导致乌鳗烂身病的病原菌。结果表明：患病乌鳗烂身处的肌肉组织出现了明显变性、坏死和炎症细胞浸润；1B琼脂培养平板培养结果显示，该菌呈边缘光滑有光泽的圆形白色菌落，为革兰氏阴性菌；16SrRNA基因进化分析显示，菌株ZS20230317与维氏气单胞菌Aeromonasveronii的亲缘关系最近，一致性高达9

2、8.5%；生理生化试验显示，该菌的赖氨酸脱竣酶、甘露醇、覃糖、蔗糖、氧化酶和VP等生理生化反应为阳性；药敏试验显示，该菌对氯霉素、头抱他咤、头泡氨节、头泡理林和头泡拉定沙星等20种抗生素药物敏感，对氨苦西林、苯哇西林、段苇西林、青霉素G、麦迪霉素、万古霉素和克林霉素7种药物具有耐药性；人工回归感染试验证实，该菌能引起健康乌鳗死亡。研究表明，维氏气单胞菌是广东中山地区乌鳗烂身病的病原，本研究结果为乌鳗维氏气单胞菌病的防控提供了理论依据。关键词：乌鳍；烂身病；维氏气单胞菌；组织病理；药敏试验乌蜡.ChannaWrgUS隶属于鳗亚目婚科婚属鱼类，是中国淡水养殖重要品种之一，其具有出肉率高、抗应激性强

3、、营养价值高等特点，同时具有较高的药用价值。2019年中国渔业统计年鉴显示，全国乌鳗产量高达459.277t,但随着养殖规模和密度的不断扩大，水体环境持续恶化，导致该鱼发育迟缓，免疫力降低，各种病害频发，其中乌鳗烂身病尤为严重，给乌婚养殖产业发展造成了极大障碍。目前，已报道引起烂身症状的病原菌有拟态弧菌Vibriomimicus、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophi1a、维氏弧菌Vibrioharvey、丝囊霉菌AphanomycesInvadans和维氏气单胞菌AeromonasveronH等。维氏气单胞菌隶属于气单胞菌科弧菌属革兰氏阴性厌氧菌，广泛分布于自然界中，是一种人-鱼共患

4、致病菌，不仅能引起人类败血症、伤口继发性感染、肠胃炎及脑膜炎，还能感染斑点叉尾蒯Ieta1uruspunetaus黄薮鱼Pe1teObagrUSfu1vidraco、加州妒MicropterusSa1moniodes、卵形鲸觞Trachinotusovatus、泥瞰MisgurnusanguiI1icaudatus、黄鳍Monopterusa1bus、鳗鲍Angui11aJaponica、团头鲂MegaIobraaamb1ycepha1a和怀头&占Si1urusSo1datovi等多种鱼类，给水产养殖产业造成了巨大经济损失。2023年3月，在中山某乌鳗亲鱼养殖场出现大量患病乌鳗，体表多处出现烂

5、身症状，沿岸浮头，无规则游动，食欲废绝。乌鳗烂身病在中国珠江三角洲地区发现已久，且在春季低温反潮季节持续发病，有些地区发病周期甚至延长至10月底，这对乌鳗养殖业造成了严重影响。调查发现，发病乌酸养殖基地存在养殖密度过大、投喂分布集中、水质恶化等现象，这些因素都有可能导致乌鳗烂身发生。本研究中，作者从患病乌酸病灶处分离到一株优势菌，通过16SrRNA测序、生理生化鉴定、药敏分析等试验，对乌鳗烂身病病原菌特征进行了分析，并对该菌株感染后的组织病理变化进行了观察，最后通过回归感染试验确认该菌株为烂身病的主要病原，获得的结果能为乌鳗烂身病的防治提供理论依据，对乌酸的健康养殖也具有一定的实践指导意义。1

6、材料与方法1.1 材料患病乌鳗来源于广东中山某亲鱼养殖场。试验所用健康乌酸鱼苗（体长710Cn1）购自惠州某乌鳍鱼苗养殖场，暂养于实验室养殖桶，14d后用于攻毒试验，暂养期间水温控制在28C,每日投喂一次。常规使用培养基、革兰氏染色试剂盒、细菌生理生化鉴定试剂盒、药敏片等均购自广东环凯微生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 1病症观察眼观患病乌鳗体表症状,并记录；随后解剖患病乌婚体表皮肤、鳏丝、肠道等器官并用相机拍照记录。取病灶周围黏液进行水浸片观察，排除寄生虫和真菌感染后，进行下一步细菌分离纯化。1.2.2 病原菌分离纯化用体积分数75%的乙醇对患病乌鳗体表消毒，将濒死与刚死亡的患病乌鳗

7、在无菌操作台进行解剖和初步临床诊断,并对体表病灶部位进行划线分离，28C培养箱中培养10h,挑取长势与形态规格相似的单个菌落进行扩大培养，并进行后续鉴定分析。1.2.3 病原菌鉴定1）革兰氏染色。参考革兰氏染色试剂盒方法步骤，在无菌条件下进行染色及形态观察。2）生理生化鉴定。按照细菌生理生化鉴定试剂盒说明书，将培养好的菌液添加到生化鉴定管中，于37C下培养2448h后观察并记录结果。3）细菌的16SrRNA序列及其系统发育分析。按照基因组DNA提取试剂盒方法，提取纯化菌株DNA,利用生工生物工程（广州）股份有限公司合成的16SrRNA通用引物27F:AGAGTTTGATCMGGCTCAG和14

8、92R：Ggttaccttgttacgactt进行PCR扩增，产物经20g/1琼脂糖电泳检测无误后，送至生工生物工程（广州）股份有限公司进行测序并构建系统发育树。1.2.4 人工回归感染试验将此前分离到的疑似病原菌活化，28下培养12h,用于后续人工回归感染试验。参考黄浦江等的方法，使用无菌PBS将菌液浓度分别调节至2.OX10、2.0X10、2.0X10、2.OX101CFUm1,腹腔注射鱼体，每尾注射IOOu1,每组30尾，对照组注射等量无菌PBS,接种后连续观察一周，每天记录乌鳗发病情况，参考黄浦江等方法计算半致死浓度（U1）,连续观察期间出现死亡病例，及时分离并鉴定病原菌。1.2.5病

9、原菌药敏试验参考黄浦江等的方法，选取30种抗生素药敏片对致病菌进行药敏试验（判断依据为WST125-1999）o1.2.6组织病理检验患病乌健体表使用体积分数75%的乙醇进行消毒，取体表病灶处代表性样品，切块置于体积分数4%的组织细胞固定液中，送至武汉塞维尔生物（广州）科技有限公司进行组织病理制片。2结果与分析2.1患病乌鳍病症观察眼观患病乌螳体表主要病变为烂身（图1）,体表鳞片脱落（图1A）,体表多处出现溃疡灶（图1B）,鲤盖处可见糜烂血块（图10,尾部存在少量出血点（图1D）。解剖观察体内感染情况，发现其腹腔有黄色积液,内部组织未见异常。A一体表鳞片脱落（t）；B一体表溃疡灶（）；C鲤盖糜

10、烂（t）；D一尾部出血点（t）oA-exfo1iationofbodysurfacesca1es（t）；B-u1cerfoca1intheskin（）;C-gi11erosion（t）;D-b1eedingspotsinfishtai1（t）.图1患病乌醴症状Fig.1SymptomsofsickChinesesnakeheadChannaargus2.2病原菌的分离与革兰氏染色从患烂身病乌鳍病灶处分离到一株优势菌，命名为ZS20230317。随后对该菌株进行革兰氏染色鉴定，发现该菌为革兰氏阴性菌。显微镜下观察该菌呈短杆状，边缘光滑整齐。2.3序列分析及系统发育树的构建用细菌16SrRNA通用

11、引物扩增菌株ZS20230317的16SrRNA基因，并将其测序结果进行拼接，随后与GenBank数据库中已公布的其他菌株的16SrRNA基因序列进行比对，发现菌株ZS20230317与已知维氏气单胞菌一致性最高，为98.5%。选取NCB1中部分维氏气单胞菌16SrRNA序列，并利用Mega5.2软件，采用N-J法构建系统进化树，结果显示，菌株ZS20230317与维氏气单胞菌KC166864聚为一支，亲缘关系最近（图2）。I0)I94I-A.sa1monicidaNR119042611I-A.enche1eiaNRJ1804270A.mediaNR_036911f-A.Iaiwanensis

12、NR_116585A.caviaeNR029252,A.hydmpfi必NRj90A.a11osaccharophi1aNR_025945AJandaeiNR037013jA.vemniiMK548536IA.vemniiKC166864ZS2023031799,分离菌株ZS20230317。,Iso1atedbacteria1strainSZ20230317.图2基于分离菌16SrRNA基因序列构建的系统进化树Fig.2Phy1ogenetictreeofiso1atedbacteriabasedon16SrRNAgenesequence2.4分离株的生理生化鉴定分离株ZS20230317经

13、生理生化鉴定显示（表1）,该菌的赖氨酸脱竣酶、氧化酶、VP试验、MR等生理生化反应为阳性，可利用覃糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖，不能分解乳糖，能直接生长在半固体琼脂上，三糖铁试验无法分解乳糖，产H6气，该分离菌与本实验室分离的维氏气单胞菌的生理生化特性基本一致。表1分离菌的生理生化鉴定结果Tab.1Physio1ogica1andbiochemica1identificationresu1tsofiso1atedbacteria生化试验biochemica1test结果resu1t菌株ZS2O2OO317维氏气单胞菌A.Verenii3%NaQ半固体琼脂+NaC1(3%)moti1itytestm

14、edium3%Nae1赖氨酸脱竣醉+NaC1(3%)1ysinedecarboxy1ase3%NaC1葡萄糖（产气）NaC1(3%)g1ucose(gasproduction)3%NaC1甘露醇NaC1(3%)mannito+草幡treha1oseanhydrousB一半乳糖昔ONPG+3%NaC1蔗糖NaCI(3)sucrose+M.R.反应M.R.test+三铁糖试验TS1test+0%NaCI陈水生长growthinNaCI+弧aCI陈水生长growthinNaC1+8然NaCI陈水生长growthinNaC1g淞a。陈水生长growthinNaC1(8%)10NaCI陈水生长growt

15、hinNaCK10%)氧化醉活性OXaSeactivity+V-P试验V-Ptcst+注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。Note:+,positive;-,negative.综合形态学观察、革兰氏染色、16SrRNA及生理生化特性结果，可鉴定菌株ZS20230317为维氏气单胞菌。2. 5药敏试验菌株ZS20230317对30种抗生素药物敏感性结果显示（表2）,该菌株对氨苇西林、苯理西林、皎茉西林、青霉素G、麦迪霉素、万古霉素和克林霉素7种药物耐受;对新霉素、吠喃I些酮和复方新诺明中度敏感；对头泡他咤、多粘菌素B、四环素等20种药物敏感。表2药敏试验结果Tab.2Resu1tsofdrugsensitivitytest抗生素antibiotic剂量/(gdisc1)dose抑菌圈直径mmdiameterofinhibition药物敏感性drugsensitivity氨芳西林Ampici11in100R头跑他碇Ceftazidinie3030