基因组Ⅰ型和Ⅴ型传染性胰脏坏死病毒的分离与鉴定.docx

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1、摘要：为调查造成中国西北某虹鱼尊Oncorhynchusnykiss养殖场幼鱼出现持续性死亡的病因，采用组织病理切片观察及分子鉴定的方法对患病虹酶进行了鞋鳞常见病毒筛查，同时采用系统发育分析、电镜观察、滴度测定及人工回归感染等方法对分离获得的毒株进行了基因型分析、显微结构观察及毒力特性分析等研究。结果表明：患病虹鳞的肝、脾及肾组织细胞发生广泛性坏死，并伴随空泡化及溶解等现象；由病鱼内脏组织制备的组织匀浆悬液均能够感染CHSE-214细胞并产生典型细胞病变(CPE)；从该养殖场的不同养殖区域共分离到3株传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPN

2、V),其中IPNV-F1和IPNV-W2属于基因组I型，分别与IPNV中国分离株WZ2016(KX355401)和ChRtnI213(KX234591)同源性最高，VPZ基因片段序列一致性分别为100%和98.5%,IPNV-W1属于基因组V型，与意大利毒株IPNV/0吸公5/1犷208八&88。垢543567)同源性最高，二者的勿2基因片段序列一致性为99.1%；接种病毒后的CHSE-214细胞内存在大量呈晶格状排列的无囊膜病毒粒子，3株IPNV分离株在CHSE-214细胞上的平均滴度分别为10”TCIDO.11(IPNV-F1),10-TCIDO.1m1(IPNV-W1)10-TCIDO.

3、1m1(IPNV-W2);分别以0.1m1尾的剂量向健康虹蹲幼鱼腹腔注射各IPNV分离株，在攻毒后60d内虹蹲未出现死亡，攻毒后30d时，病毒在组织中的平均滴度分别为10-TCIDO.1g组织QPNV-F1)、10-TCIDO.1g组织(IPNVTD和10TCIDO.1g组织(IPNVT2),攻毒后60d时，病毒在组织中TCIDO.1的平均滴度下降为IOyTCIDO.1g组织QPNV-F1)、3g组织(IPNVT1)和10-TCID0.1g组织(IPNV72)。研究表明，该发病养殖场同时存在基因组I型和V型的IPNV,本研究首次从同一养殖场分离到两种基因型的IPNV,可为中国传染性胰脏坏死病Q

4、PN)的防控提供参考。关键词：虹醇；传染性胰脏坏死病毒；基因组I型；基因组V型虹鲤Oncorhynchusmykiss是中国主要冷水鱼养殖品种，广泛分布在中国东北、西北、西南等冷水资源较发达的地区，在带动当地经济发展、促进渔民增收方面发挥了积极的作用。随着养殖规模的扩大、苗种的频繁流通，虹醇病害频发，严重制约了冷水鱼养殖业的绿色健康发展。传染性胰脏坏死病(infectiouspancreaticnecrosis,IPN)是一种全球流行性疾病，于20世纪50年代在美国开始流行，至今已传播到法国、土耳其、智利、墨西哥、芬兰、挪威、西班牙、日本、韩国和伊朗等国家，给鱼圭蹲鱼养殖业造成了较大的经济损失

5、。该病是由传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)引起的一种病毒性疾病，主要威胁能科鱼类。IPNV隶属于双RNA病毒科Birnavirdate水生双RNA病毒属Aquabirnavirus,其病毒粒子无囊膜包裹，呈二十面体。IPNV的基因组由A和B两条RNA组成。A链包含两个重叠的开放阅读框(OPenreadingframe,ORF),其中较大的ORF编码外衣壳蛋白VP2、内衣壳蛋白VP3和蛋白酶VP4,小ORF编码非结构多肽VP5oB链编码RNA依赖性RNA聚合酶VP1,用于转录和复制病毒基因组。利用交叉中和测定法可将水生双RNA病毒

6、分为A和B两个血清群(SerOgrOUP),其中，血清群A包含9种血清型，即A1(WestBuxton,WB)、A2(Spajarup,Sp)、A3(Abi1d,Ab)、A4(Hecht,He)A5(Te11ina,Te)、A6(Canada1,C1)A7(Canada2,C2)、A8(Canada3,C3)和A9(Jasper,Ja),血清群B仅具有血清型B1。利用系统发育分析方法，可将水生双RNA病毒分为7个基因型，包括基因组IV(genogroupIV)目前IPNV基因型主要分布在基因组IVI。中国于20世纪80年代首次暴发IPN疫情。该病在中国已经流行了30余年，造成了巨大的经济损失，

7、成为制约中国鞋蹲鱼产业发展的重要疫病之一。已知的中国境内分离的IPNV为基因组V型和基因组I型。2023年，中国西北某虹鳄养殖场幼鱼发生持续性死亡，死亡历程延续4个月之久，累计死亡率近20虬为探究造成虹醇幼鱼死亡的病因，本研究团队开展了流行病学调查工作，本研究中对患病虹鳞进行了组织病理学观察，对病原进行分离鉴定，并进行了病毒分离株的系统发育分析、电镜观察及人工回归感染试验，以期为虹蹲养殖业中的疾病防控提供参考。1材料与方法1.1 材料大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(ChinOoksa1monembryoce11s,CHSE214)和胖头觞上皮细胞(epithe1iomapapu1osumcyprini,

8、EPC)由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害教研室曾令兵研究员惠赠。PrimeScriptwOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒、TriZO1试剂、D12000marker购自宝生物工程（大连）有限公司。胎牛血清（feta1bovineserum,FBS）、胰酶（体积分数0.25%的EDTA-TyriSin）、M199培养基购自GibCO公司。健康虹蹲（平均体质量5g）购自辽宁本溪艾格莫林实业有限公司。1.2 方法1.2.1 样本信息及组织病理学观察本试验中共采集了3份患病虹醇样品，分别取自发病养殖场的孵化车间（体质量35g,命名为FD及养殖区域的两个不同网箱（体质量2030

9、g,分别命名为W1和W2）。分别取患病鱼的肝、脾及肾组织，使用波恩氏液进行固定。用石蜡包埋制作切片后进行H.E染色。采用中性树脂胶封片后，利用光学显微镜观察组织病理变化。1.2.2 病毒的分离培养取患病虹醇的肝、脾、头肾组织混合匀浆，4下以12000r/min离心5min。用0.22Rm无菌过滤器对离心后的上清液进行无菌处理，然后用细胞维持液（含体积分数2%胎牛血清、100IUm1青霉素和链霉素的M199培养基）将无菌组织匀浆上清液稀释10倍接种于CHSE-214及EPC单层细胞，于15C培养箱中吸附1h后弃上清液，补加细胞维持液后置于15C培养箱中培养。7d内每天利用倒置显微镜观察细胞状态。

10、若出现细胞病变（CytOPathiCeffect,CPE）,则待80%的细胞出现病变时，收获细胞培养物储存于-80C超低温冰箱中；若未出现细胞病变，将细胞培养物进行盲传，如果7d内观察到细胞病变则收获细胞培养液存于-80C超低温冰箱中，若无细胞病变则判定该样本为目标病毒阴性。1.2.3 病毒的RT-PCR鉴定根据中华人民共和国国家标准传染性造血器官坏死病毒诊断规程(GB/T15805.22017)合成扩增传染性造血器官坏死病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus,IHNV)部分G基因的引物，其扩增片段大小为693bpo根据文献25合成扩增IPNV部分侬基因

11、的引物，其扩增片段大小为584bp。以TriZO1试剂提取的上述细胞培养物总RNA为模板，使用OneStepRT-PCRKit,分别利用上述引物对细胞培养物进行鉴定。一步法RT-PCR扩增反应的步骤为：50反转录30min；95下预变性4min；95C下变性30s,55下退火30s,72下延伸60s,共进行35个循环；最后在72下终延伸10mio扩增产物用10g/1琼脂糖凝胶电泳进行分析。阳性PCR样本由吉林省库美生物(中国长春)纯化并进行基因序列测定。利用Nationa1CenterforBiotechno1ogyInfonnatiOn(NCBD中的B1AST对鉴定的基因序列进行比对分析。1

12、.2.4 IPNV系统发育分析选用地基因序列，使用MEGAX软件中的最大似然法，采用自展值(bootstrap)为IooO,最佳核甘酸代替模型为GTR+G,对分离的IPNV毒株进行系统发育分析。利用MegaIigrI软件计算本研究中分离的IPNV毒株与基因组IV型水生双RNA病毒VPZ基因序列的一致性。本研究中使用的参考毒株信息见表1。表1本研究所用的参考毒株Tab.1Referencevirusstrainsusedinthisstudy序号毒株基因组来源GcnBank登录号No.straingcogrouporiginaccessionnumber1VR299基因组I型美国F3435722

13、ChRtm213基因组I型中国KX2345913Buh1基因组I型美国AF3435734AM-98基因组I型日本Y2837805Jasper基因组【型加拿大NC_OO19156WZ2016基因组I型中国KX355401719F3b基因组I型西班牙AY780921825347基因组I型智利KU6O957591KJH6基因组I型智利KU60958910Canada2基因组II型加拿大F34273311Canada3基因组【1型加拿大AF34273412578基因组I1I型西班牙AJ489228132290基因组U1型西班牙AJ48922414Canada1基因组IV型加拿大F34273115IPN

14、VO.mykiss/IPN208Mar88基因组V型意大利MG543567161146基因组V型意大利AJ48922217SP基因组V型丹麦AF34272818666/12基因组V型芬兰KY54851519NVI-016基因组型挪威AY379742201-4基因组V型伊朗HQ45719721He基因组V1型德国AF34273O2294/01基因组V1型芬兰KY54850923Y-98基因组1型日本AY28378524GC-I基因组1型韩国Y06439625POBV基因组M1型中国EU1612851.2.5 IPNV的电镜观察收集出现细胞病变的CHSE-214细胞，用PBS磷酸缓冲溶液洗涤3次，

15、用体积分数2.5%的戊二醛溶液在4C下固定24ho然后用体积分数1%的四氧化钺在25C下固定70min并使用乙醇溶液脱色。用丙酮冲洗细胞后，将其包埋在树脂中，用乙酸铀酰-柠檬酸铅染色，然后使用透射电子显微镜（Hitaehi7650,日本）对细胞内病毒粒子进行观察。1.2.6 IPNv滴度的测定使用CHSE-214细胞对IPNV分离株的半数组织培养物感染剂量(tissuecu1tureinfectivedose,TC1DS)进行测定。具体方法如下：将CHSE-214细胞接种到96孔细胞培养板中，当细胞汇合成单层细胞，将体外传代3次的IPNV病毒悬液用细胞维持液进行10倍梯度稀释(Io-10),接种于96孔细胞培养板，每个稀释度接8个孔，每孔接100U1o同时设置只添加细胞维持夜的细胞作为阴性对照。将接种好的96孔细胞培养板置于15C培养箱中培养7d,对出现病变及未病变的细胞孔进行计数，并按Reed-Muench公式计算IPNV分离株的滴度。1.