植酸酶测定.docx

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1、植酸酶活性测定植酸(Phyticacid).其化学名称为六磷酸肌醇，由1分子肌醇和6分于鳞酸结合而成，分子式是C6H18O24P6,通式为C6H6OPO(OH)26,分子660.8。植酸及植酸盐中的磷即为植酸磷，植酸广泛存在于谷物籽实和油料作物种子。植酸酶(phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，因此破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力，所以说植酸酶能增加矿物元素的营养效价，而且由于释放出的Ca2可参加交联或其他反应中去，从而改变了植物性食品的质地。植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。植物体中的植酸一般不以游离形式存在，而

2、是与钙、镁、钠、钾等结合形成复合盐，植酸盐在多数植物中以植酸钙镁复盐的形式存在，但大麦中主要是植酸钾镁复盐，小麦中主要是植酸铁。饲料中的无机磷可直接为肠道所吸收，而有机磷则需要先经酶的作用水解为无机磷，然后方能为肠道吸收。单胃动物消化道中无分解植酸的植酸酶，故对植酸磷的利用率很低。植酸的抗营养作用不仅表现在植酸磷的低利用率上，还通过整合或络合作用影响其它矿物元素如铁、锌、铜、钙以及蛋白质的可消化性，并抑制淀粉酶、胰蛋白酶、胄蛋白酶的活性。测定原理植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷，通过加入锐铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的帆铝磷络合物(NHQPO

3、4NH4VO3-16MoO3;,在415nm波长下测定磷的含量，以标准磷溶液为参照，计算酶活。植酸酶的含量以酶活性单位表示。1植酸酶单位定义为:在37、pH5.5的条件下，1分钟内从0.005ImOI1的植酸钠溶液中释放出1微摩尔(UmoD无机磷所需要的植酸酶量。操作步骤样品准备样品粉碎过后过60目筛。称取2.0g左右粉碎样品，放入4个IOom1烧杯中(每种样品4个重复)。加入50m1浓度为0.25m1、PH为5.50、在冰箱中冷却的乙酸缓冲液并用磁力搅拌器搅动60分钟，使酶蛋白充分溶出，制成一个悬浮液。将此悬浮液用滤纸过滤，定容至IOOm1,得植酸能粗能溶液。在测定前，植酸酶提取液均需放置于

4、冰箱中低温保存。标准曲线植酸酶的含量以酶活单位表示，植酸酶水解植酸钠释放出无机磷，通过加入帆铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时加入水解释放出的无机磷产生颜色反应。以微量取样器吸取3.00Om1植酸钠溶液,分别注入8只已编了号的IOm1的离心管中，于第一只管中加入1.0OOm1三重蒸僧水，其余7只依次加入1.000m1不同浓度的磷标准液，置于37水浴锅中温育Ih,分别加入4.00Om1锐铝酸筱显色/终止液，混匀后静置20min,在分光光度计于415nm波长处以蒸储水管作空白对照测吸光度，同时输入各管含磷量，建立吸光度一磷浓度标准曲线。样品测定取4只已标号的IOmI离心管，其中一只作空白对照，分别加入3.0OOm1植酸钠溶液,置于37C水浴锅中预热5分钟,然后以相同间隔依次在反应管中加入1OoOm1提取出的植酸随溶液,在37C水浴锅中温育1h,按与加入酶液相同的顺序和时间间隔加入4.000m1帆钳酸钱显色/终止液,然后在空白管中加入1.0m1植酸酶提取液，混合摇匀，3000转/分离心15分钟。在分光光度计于415nm波长处以空白管作对照测吸光度,读取无机磷浓度。植酸酶活性(ukg)=C100(60m)C二分光光度计数值，m=样品质量(g),100为稀释倍数，60为反应时间(分钟)。