流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规范.docx

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1、流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规范流感病毒的血凝素(HA)能够引起多种禽类和哺乳动物的红细胞发生凝集，因此而得名。用于检测流感病毒滴度的红细胞凝集试验也是根据病毒的这一特性而建立的。当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则可以抑制红细胞凝集的出现，即为红细胞凝集抑制试验(HI)的理论根据。微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型的方法。该方法简单、易行、结果可信。用于HI的标准参照血清必须及时更新，要包括当年的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。()生物安全要求生物安全要求及个人防护要求与流感

2、病毒的分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。(二)实验所用试剂1 .抗原：季节性A(HIN1)、A(H3N2)B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液2 .抗血清：经RDE或者过碘酸钾处理后的季节性A(H1N1)A(H3N2)B-Yamagata系、B-ViCtoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。（）其他试剂/材料/仪器（试剂盒中不包含）1 .红细胞悬液2 .PBS缓冲液,PH7.43 .水浴箱（37,56）4 .台式离心机5 .多道可调加样器6 .离心管7 .96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用底板，使用鸡/火鸡红细胞进行实验最好用“V”底板

3、，底板也可使用）、可调多通道加样器、单道加样器等。8 .200ukIoooUrnP头、水槽流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞鸡火鸡豚鼠人“0”型血终浓度0.50.50.750.75孔底部形状V型V型U型U型孵育时间30min30min45min60min红:维1胞细胞沉积成点细胞沉积成点细胞沉细胞沉沉积形状，倾斜时细胞状，倾斜时细胞积成环积成环状向下流成泪滴状向下流成泪滴状状(四)流感病毒鉴定步骤1 .红细胞配置如用火鸡、鸡的红细胞，工作液浓度为1%,如用人“0”型、豚鼠红细胞，工作浓度为1.5%。下面介绍WHo流感参比与合作中心提供的红细胞标定的方法：(1) S液中的红细胞，1200r

4、min离心5min,弃上清。(2)加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，12007min离心5min,弃上清。(3) PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后，1200rmin离心IOmino(4)将红细胞稀释至合适的浓度。注:AS液全称为A1SeVer氏液。配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g柠檬酸0.055g氯化钠0.42g去离子水加至IoOm1,微热溶解，将PH值调到6.1,8磅20min高压灭菌，4C贮存备用。2 .流感毒株HA滴度的测定(1)在微量血凝板的第2-12列加入50u1PBS(PH7.4)o(2)在第一列(A1G1)中加入IOoUI病毒悬液。3 3)H1力口入IooU1PB

5、S,作为红细胞阴性对照。（4）从第一列各孔吸50UI病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去50山。（5）在每孔中加入50UI红细胞悬液，轻拍血凝板，充分混匀。（6）室温孵育，孵育时间见表：流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较。3.HA试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集，以记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。HA滴度判定举例病毒稀释度HA1:1:1:1:1:11:31:61:11:21:51:101:20滴12486242856122448度123456789101112A+

6、-2B+-8C+-16D+-32E+-64F+-12820G+48H-14.制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。（2）制备4个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每种血清做8孔稀释，每孔用抗原25u1,则测定一份血清需0.2m1抗原。根据标准血清的份数（本试剂盒包含5种标准血清）计算出实验所需病毒抗原总量。（3）其次，计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8,得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64,除以8等于8,

7、则1:8（Im1病毒液加7m1PBS）稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25u1病毒液中含有4个血凝单位（等于50u1病毒液中含有8个血凝单位）。所需抗原总量为160OUI时，4个血凝单位配置对照表HA滴度病毒液（UI）PBS(u1)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.755 .4个血凝单位抗原的复核滴定为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。操作方法同HA实验步骤。如

8、果只有前4孔出现凝集，表明每50u1病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5孔也出现凝集，说明每50u1病毒含有16个血凝单位,该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50U1病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。此外，4个血凝单位抗原必须每次用前新配置。6 .红细胞凝集抑制试验(HI)鉴定未知病毒(1)在血凝板的每孔加入25U1PBS。然后在A1A5、A7A11各列分别加入：抗季节性A(HIND流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清、抗新甲型

9、HIN1流感病毒标准参考血清25u1,A6、A12加入25U1PBS,作为阴性对照。用多道移液器从A行每个孔分别取25u1,由A至H行做2倍稀释血清,最后一行弃去25u1o(2)AI至A5各列每孔加入25u1待检抗原(4个血凝单位)阳性对照：A7至AI1各列分别加入4个血凝单位的季节性A(HINI)流感病毒标准参考抗原、季节性A(H3N2)流感病毒标准参考抗原、B-Yamagata系流感病毒标准参考抗原、B-Victoria系流感病毒标准参考抗原、新甲型H1N1流感病毒标准参考抗原各25u1孔。对照孔A6、A12各列加入25u1PBS/孔。轻拍，混匀，室温孵育30min0(3)每孔加入50UI

10、配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室温孵育30-6Omin,观察血凝抑制实验结果。(具体孵育时间根据使用的不同种血球来定，详见表1。)(4)血凝抑制效价是完全抑制血凝出现时血清的最高稀释度的倒数。7.鉴定结果判定（1） 标准参照血清对待检抗原的抑制效价N20才可以算为阳性。（2） 一种待检抗原不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制。（3） 待检抗原标准参照血清有交叉抑制，但与一种亚型（B型流感称为系）的标准参照血清抑制效价大于其他亚型参照血清4倍以上时,便可以判定为此种亚型的流感病毒。（五）注意事项1 .血红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位25u1的抗原，抗原必须新鲜配制。2 .红细胞悬液的配制

11、必须标准化。3 .正确存放试剂，避免反复冻融及污染。4 .冻干的试剂应按照说明溶解，保存。5 .任何待检病毒与一种以上的推荐抗血清反应，滴度明显大于20,可能的原因为：（1） 使用了不足4个血凝单位的抗原。（2） 细菌污染。非流感病毒来源的凝集素可以非特异的与所有的抗血清反应，也可以不发生反应。（3） 读取结果的时间不正确，只有当病毒的血凝活性恰好被完全抑制时，血抑结果才最可信。（4） 未充分去除非特异性抑制素。人和动物来源的血清存在非特异抑制素，许多敏感病毒在滴定时很容易与血清中残留的非特异性抑制素反应而引起曲解，为避免假阳性结果，要求在HI试验前预先处理血清。非特异性抑制素实质上是游离在血

12、清中类似流感病毒受体的唾液酸残基。这些类似受体的多糖类物质能与病毒血凝素分子上的受体结合部位结合，因此用于血凝抑制或其它试验的血清必须彻底清除其中所含的非特异性血凝抑制素。人和动物血清中的非特异性血凝抑制素分为a、3、三种，这三种抑制素对不同的病毒的抑制能力不同。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（RDE,受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。6 .抗原鉴定（H1法）试剂盒的标准参考血清不可与其他同类试剂盒的参考血清搭配使用。7 .血凝抑制试验包括以下对照：（1） 红细胞对照；（2） 阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；（3） 标准血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰；（4） 标准抗原对照。