不同温度对单链寡核苷酸分析的影响.docx

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1、治疗性寡核甘酸的纯化及表征是目前制药行业的一大热点。然而,寡核昔酸的表征,特别是通过离子对反相液相色谱(IP-RP1C)进行表征,可能会非常具有挑战性。治疗性寡核甘酸是通过固相合成制造,也就是核普酸以特定合成步骤进行循环。因此,我们必须对n-1和n+1等杂质进行表征,这其中可能需要大量的方法开发步骤来进行优化。此外,我们可能还需要对其他密切相关的杂质进行表征和定量,例如硫代磷酸酯的氧化。另一个挑战是在寡核昔酸分析中可能会观察到的色谱的变化。保留时间、峰形和峰面积回收率可能在一个序列的进样之间变化。这些变化的一个可能原因是有会影响色谱性能的分子内相互作用。因此,我们通常会采用超过60C的高温来改

2、善分离。虽然这是处理双链寡核昔酸(如siRNA)时的基本要求,但单链寡核甘酸是否也有必要在高温下分析是一个值得讨论的问题。在此技术笔记中,我们展示了温度对两种寡核甘酸,一种5共朝寡核甘酸和一种硫代磷酸酯,的影响,以及如何将其用于单链寡核普酸的方法开发过程。图1说明了以5C为增量增加方法运行温度的效果。和其他色谱方法类似,5匚氨基C12寡核甘酸的保留时间随着温度升高而减少。通常,效率和峰形在更高的温度下会得到改善,但是在本示例中没有观察到这一点。此外,在比较45C和65C的杂质分布时,图中几乎没有显示出明显差异。因此,人们可能会得出结论,选择性没有受到温度的影响。为了更好地确认选择性变化,需要使

3、用质谱来识别和表征杂质峰。具有未知序列的22mcrDNA硫代磷酸酯通过高分辨率MS进行分析。硫代酸盐的测量质量为6772.6Dao我们在不同温度下进行寡核甘酸的分析,以观察杂质分析选择性的变化。在比较60和70C下运行的方法时(图2),如预期所示,在较高运行温度下,主峰的保留显着降低。然而,两种方法都给出了相似的杂质谱。我们观察到了三种较早洗脱的杂质。解卷积质谱证实了相同的洗脱顺序。杂质峰1为6443.4Da,峰2为6468.4Da,峰3为6170.8Da。两种运行条件下峰1的解卷积光谱如图3所示。有趣的是,峰1和2可能都是口一1杂质,峰1是目标序列减去鸟昔,峰2是目标序列减去胸普。总的来说不

4、同温度通常用于寡核甘酸分析的方法开发。然而,对于单链寡核甘酸,在超过60的温度下运行可能并没有太大提升。因为温度的升高可能不会改善色谱分离,也不会影响选择性,正如我们在其他大分子中观察到的一样。液相色谱条件色谱柱:bioZen2.6mO1igo规格:IOOX2.1mm(图1)00D-4790-AN150X2.1mm(图2,3)00F-4790-AN流动相:图1:A: 12.5mMHFIP,4mMTEA水溶液B: 12.5mMHFIP,4mMTEA甲醇溶液图2,3:A: 100mMHFIP,4mMTEA水溶液B: 100mMHFIP,4mMTEA甲醇溶液梯度:5-30%B于14分钟内(图1)25-95%B于15分钟内(图2,3)流速:0.3m1min进样量:IU1温度:如图所示检测器:UV260nm(图1,2)TOF-MS(图3)样品:5J氮基C12寡核甘酸(图1)DNA22mer硫代磷酸酯(图2,3)c45C5055OC60-C65gesz9ddv1012.515Tm.nin温度对5二氨基C12寡核甘酸的影响8693O-Qa图2:22merDNA硫代磷酸酯的杂质谱图ZCBSZQ-&图3:杂质峰1的解卷积谱图

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