受体的放射配基结合分析.docx
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1、受体的放射配基结合分析一、原理用放射性核素标记配基与相应的受体进行特异结合,测定复合物的放射性活度,从而对受体进行定性和定量,该分析方法称为受体的放射配基结合分析(radio1igandbindingassay,RBA)o受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律,可用下式表示:K1,V1R1R1(1)K2,V2式中R和1为游离受体和游离配基的浓度,R1为复合物浓度,k1和k2为结合速率常数(associationrateconstant)和解离速率常数(dissociationrateconstant)o结合反应达到平衡时,对一定量的受体RT来说,R1的量取决于所加标记配基的量1T和配基
2、与受体的亲和力(用平衡解离常数equi1ibriumdissociationconstant即KD来表示,KD=k2k1=R1R1)o1 .饱和曲线当标记配基浓度1T较低时,只有部分RT形成R1,1T越大形成的R1越多。但是由于RT数量有限,所以R1不是直线上升,而是上升先快后慢的曲线,当1T超过RT很多时,R1的上升就非常缓慢,接近慢T了,这就是饱和曲线。曲线的高度取决于受体的总数RT。在曲线起始段,相同量的1T形成的R1量取决于配基与受体的亲和力,所以,KD越小(亲和力越大),饱和曲线上升越快。2 .竞争性取代反应(competitivedisp1acementreaction)若受体和放
3、射配基的结合反应系统中另加入该受体的非标记配基,则后者会与放射配基竞争受体。非标记的配基可以是激动剂(agonist),也可以是拮抗剂(antagonist)o如果在竞争反应中固定放射配基量1T,改变竞争剂的量IT,则随IT增加而复合物放射性R1逐步减少,这就是“竞争抑制曲线如果用竞争剂浓度的对数作横坐标,复合物的放射性作纵坐标,则对单位点系统(系统中能与放射性配基结合的受体是单一的,亲和力都一样)来说,竞争抑制曲线是对称的反S形曲线。竞争剂的亲和力越高,曲线在坐标图上的位置越靠左。这种方法对比较不同配基与同一种受体的亲和力非常有用。当系统中的受体有两种或更多种的结合位点能以不同的亲和力和配基
4、结合,或者结合过程中有正协同或负协同,则饱和曲线和竞争抑制曲线的形状都比较复杂,主要用于研究工作,临床上应用较少。本文仅讨论简单(无正、负协同)单结合位点的系统。二、放射配基结合反应的基本条件1.受体标本的制备1) 分离亚细胞组分:多数RBA需经差速离心法分出胞膜、胞浆、胞核等所需的组分进行分析。其优点是:除去大部分杂蛋白和内源性配基,减少NSB或其它干扰因素。受体蛋白浓缩,可获得较可靠的分析结果。组织块或细胞悬液先在含0.25-0.3mo11蔗糖的缓冲液中制成匀浆,先低速后高速进行离心,分离不同的亚细胞组分。为保证受体的结合活性,整个制膜过程必须在4C以下操作;缓冲液(Tris-HC1或磷酸
5、盐系统等)应有适宜的离子强度、PH值(7.47.8),有的受体需加EDTA、Mg-蛋白酶抑制剂等。据作者的经验,小块组织-70。C可保存3个月之久,膜制剂在-70。C的保存比组织块更好。2) 完整活细胞:血细胞、肝或脾细胞、肿瘤的腹水型细胞、传代或原代培养细胞等的悬液可用完整活细胞进行RBA反应。主要优点是:可同时观察受体结合特性和细胞的其它生物效应;受体处于接近正常的环境中,得到的结果更能反映受体的生理特性;能直接给出平均每一细胞的受体分子数。3) 组织切片:为保持组织切片中受体的活性,通常用冰冻切片,标本厚度550m,粘贴于涂有明胶的玻片上,滴加含放射配基的缓冲液进行结合反应。然后洗去多余
6、的游离配基,刮下组织切片测放射性活度,也可用放射自显影或免疫组化研究受体的分布。2 .标记配基的选择受体的RBA不用标准品,只能通过放射配基的用量和比活度,以及测定结合部分的放射性活度,计算出受体的有关参数。因此对所用的标记配基有很严格的要求。1)高比活度:RBA标本中受体数量一般都很少,约为0.0011pmo1mg蛋白,要得到满意的结果就必需用高比活度配基。通常要求3.7IO11Bq(IOCi)/mmo1以上。2)高亲和力:亲和力高的标记配基在浓度较低时便可达到饱和,因此用量可节省。此外,形成的复合物解离常较慢,有利于结合和游离配基的分离。3)高特异性:首先是与其它种类的受体交叉反应要尽量少
7、,否则需预先除去标本中有交叉反应的受体。对于有两种以上亚型的标本,还需注意配基对亚型的选择性。4)高放射化学纯度:RBA中受体参数的计算以标记配基的用量和比活度为依据,较多的放射性杂质有时可导致计算错误。一般要求放化纯度在95%以上。3 .非标记配基的选择非标记配基有两个用处。一是测定NSB,二是在竞争结合反应中作竞争剂,此处主要说明如何测定NSB。测NSB的做法是:在测定总结合TB时,同时设置一系列平行管,除相同量的标记配基及受体标本外,另加入非标记配基,后者可以是标记配基的同种或异种化合物,但必须与该种受体有高亲和力。非标记配基的用量应使99%以上的受体不再与标记配基结合,如此测得的结合部
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