受体的放射配基结合分析.docx

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1、受体的放射配基结合分析一、原理用放射性核素标记配基与相应的受体进行特异结合，测定复合物的放射性活度，从而对受体进行定性和定量，该分析方法称为受体的放射配基结合分析(radio1igandbindingassay,RBA)o受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可用下式表示：K1,V1R1R1(1)K2,V2式中R和1为游离受体和游离配基的浓度，R1为复合物浓度，k1和k2为结合速率常数(associationrateconstant)和解离速率常数(dissociationrateconstant)o结合反应达到平衡时，对一定量的受体RT来说，R1的量取决于所加标记配基的量1T和配基

2、与受体的亲和力(用平衡解离常数equi1ibriumdissociationconstant即KD来表示,KD=k2k1=R1R1)o1 .饱和曲线当标记配基浓度1T较低时，只有部分RT形成R1,1T越大形成的R1越多。但是由于RT数量有限，所以R1不是直线上升，而是上升先快后慢的曲线，当1T超过RT很多时，R1的上升就非常缓慢，接近慢T了,这就是饱和曲线。曲线的高度取决于受体的总数RT。在曲线起始段，相同量的1T形成的R1量取决于配基与受体的亲和力，所以，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快。2 .竞争性取代反应(competitivedisp1acementreaction)若受体和放

3、射配基的结合反应系统中另加入该受体的非标记配基，则后者会与放射配基竞争受体。非标记的配基可以是激动剂(agonist),也可以是拮抗剂(antagonist)o如果在竞争反应中固定放射配基量1T,改变竞争剂的量IT,则随IT增加而复合物放射性R1逐步减少，这就是“竞争抑制曲线如果用竞争剂浓度的对数作横坐标，复合物的放射性作纵坐标，则对单位点系统(系统中能与放射性配基结合的受体是单一的，亲和力都一样)来说，竞争抑制曲线是对称的反S形曲线。竞争剂的亲和力越高，曲线在坐标图上的位置越靠左。这种方法对比较不同配基与同一种受体的亲和力非常有用。当系统中的受体有两种或更多种的结合位点能以不同的亲和力和配基

4、结合，或者结合过程中有正协同或负协同，则饱和曲线和竞争抑制曲线的形状都比较复杂，主要用于研究工作，临床上应用较少。本文仅讨论简单(无正、负协同)单结合位点的系统。二、放射配基结合反应的基本条件1.受体标本的制备1) 分离亚细胞组分：多数RBA需经差速离心法分出胞膜、胞浆、胞核等所需的组分进行分析。其优点是：除去大部分杂蛋白和内源性配基，减少NSB或其它干扰因素。受体蛋白浓缩，可获得较可靠的分析结果。组织块或细胞悬液先在含0.25-0.3mo11蔗糖的缓冲液中制成匀浆，先低速后高速进行离心,分离不同的亚细胞组分。为保证受体的结合活性，整个制膜过程必须在4C以下操作；缓冲液(Tris-HC1或磷酸

5、盐系统等)应有适宜的离子强度、PH值(7.47.8),有的受体需加EDTA、Mg-蛋白酶抑制剂等。据作者的经验，小块组织-70。C可保存3个月之久，膜制剂在-70。C的保存比组织块更好。2) 完整活细胞：血细胞、肝或脾细胞、肿瘤的腹水型细胞、传代或原代培养细胞等的悬液可用完整活细胞进行RBA反应。主要优点是：可同时观察受体结合特性和细胞的其它生物效应；受体处于接近正常的环境中，得到的结果更能反映受体的生理特性；能直接给出平均每一细胞的受体分子数。3) 组织切片：为保持组织切片中受体的活性，通常用冰冻切片，标本厚度550m,粘贴于涂有明胶的玻片上，滴加含放射配基的缓冲液进行结合反应。然后洗去多余

6、的游离配基，刮下组织切片测放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体的分布。2 .标记配基的选择受体的RBA不用标准品，只能通过放射配基的用量和比活度，以及测定结合部分的放射性活度，计算出受体的有关参数。因此对所用的标记配基有很严格的要求。1)高比活度：RBA标本中受体数量一般都很少，约为0.0011pmo1mg蛋白，要得到满意的结果就必需用高比活度配基。通常要求3.7IO11Bq(IOCi)/mmo1以上。2）高亲和力：亲和力高的标记配基在浓度较低时便可达到饱和，因此用量可节省。此外，形成的复合物解离常较慢，有利于结合和游离配基的分离。3）高特异性：首先是与其它种类的受体交叉反应要尽量少

7、，否则需预先除去标本中有交叉反应的受体。对于有两种以上亚型的标本，还需注意配基对亚型的选择性。4）高放射化学纯度：RBA中受体参数的计算以标记配基的用量和比活度为依据，较多的放射性杂质有时可导致计算错误。一般要求放化纯度在95%以上。3 .非标记配基的选择非标记配基有两个用处。一是测定NSB,二是在竞争结合反应中作竞争剂，此处主要说明如何测定NSB。测NSB的做法是：在测定总结合TB时，同时设置一系列平行管，除相同量的标记配基及受体标本外，另加入非标记配基，后者可以是标记配基的同种或异种化合物，但必须与该种受体有高亲和力。非标记配基的用量应使99%以上的受体不再与标记配基结合，如此测得的结合部

8、分放射性代表非特异结合NSB。NSB通常由结合属大容量低亲和力，往往随1T的增加而直线上升,如果实验中测定不同1T的如1（如在多点饱和曲线系统中），仅需作34点，通过直线回归即可求出任何1T的NSB。4 .结合反应的类型1）多点饱和曲线：每一受体标本做68个实验点（双位点需更多些），逐点增加标记配基的量，低剂量应覆盖不饱和区，高剂量应覆盖饱和区，以便得到较典型的饱和曲线。此法能给出较多参数，如RT.KD.反映实验误差大小的平均残差等，可信度也较高，但工作量较大。2）单点法：通常在多点饱和曲线上选一个使受体基本饱和的标记配基量，根据结合部分的放射活度算出受体结合位点的克分子数。该方法操作简便，所

9、需标本量少，适于临床检验和药物筛选，但只能给出受体密度，略小于饱和曲线法。5 .反应的环境条件结合反应的平衡常数随反应系统pH、缓冲液及温度等的不同而变化。故这些因素均需实验严格选择并加以固定，以保证分析的重现性。DPH、缓冲液：结合反应的PH应处于生理范围（pH78）,常用缓冲液为Tris-HC1和磷酸盐系统等，完整细胞反应系统可用Hanks液等细胞培养液。缓冲液离子强度有一定要求，一般是1050mmo11o标记和非标记化合物、受体标本均以该缓冲液稀释配制。2)温育温度和时间：温度是影响反应速率的重要因素。温度在037。C间变化，结合和解离速率逐步变大。温度低有利于复合物的稳定，但不利于原有

10、内源性配基的解离。每一具体反应系统的温度和温育时间需经预试验确定，通常都要求达到反应平衡。3)反应体积：复合物的形成量和各试剂的浓度呈正相关，因此各管的反应体积要固定，体积应适当小，通常选200500Io6 .结合与游离部分的分离分离的目的是将反应平衡后形成的标记配基和受体的复合物与游离标记配基分开，然后才能测定复合物的放射性活度。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度。低温和快速是最有效的措施。常用的分离方法有过滤、离心、吸附、透析、电泳等，凡R1A中用的分离方法基本都可以采用。对完整细胞、胞膜、胞核受体样本的分离，目前最常用的分离方法是过滤法。过滤材

11、料主要是玻璃纤维滤膜，此法操作简便、分离效果较满意。但是对有些游离的标记配基有明显的非特异吸附，使NSB升高，需要采取一定措施例如预先用牛血清白蛋白浸泡等。对胞浆受体样本的分离，往往采用葡聚糖涂膜活性碳法(DCC),或凝胶过滤法等。三、测定方法和数据处理1.单点法求受体量先通过多点饱和曲线法取标记配基饱和区的单一浓度，与一定量的膜蛋白制剂进行结合反应，1owry法定蛋白，根据复合物的放射性活度计算受体密度。该法特点是可减少受体膜标本的用量和减少工作量，适用于临床和药物的筛选但不能求亲和力。1) 试剂：以膜受体为例。选定的标记配基、测定NSB的非标记配基、待测标本均用选定的缓冲液稀释，并经预试验

12、选定各自的浓度。2) 加样步骤：全部做3复管，各总结管和NSB管全部加相同浓度的标记配基和相同量的膜蛋白，平行的NSB管另加一定量的非标记配基，用缓冲液补足到一定体积。3) 温有和分离：反应管在一定温度振摇温有一定时间(通过预实验选定)，立即通过多头细胞收集器用冰冷缓冲液终止反应，迅速抽滤至两层玻璃纤维膜上，并以IO1nI冰水淋洗。滤膜80C30min烘干，投入闪烁液内作固相测量。另取一定体积标本测定蛋白含量。4) 数据处理：先将复合物放射性测量得到的cpm换算成受体数量即fmo1数，再被标本中的蛋白量除，换算成受体密度（fmo1/mg蛋白）。因为多数复合物中受体和配基是11的关系，所以单位换

13、算的公式是：通体率度=总结合管CPm-非特异结合管CPm又一测量效率（）x配体比活度X标本的蛋白量（2）如果受体和配基以1:2的关系形成复合物，则上式还应被2除。注意上式中分子是标本的特异结合，所以需事前从总结合TB减去非特异结合NSB。配基比活度应换算成dpm/fmo1。标本的蛋白量需用生化方法测定。Bradford法只适用于可溶性蛋白，结合在膜或核上的蛋白以1oWry法较可靠。完整细胞也可不定蛋白而对细胞进行计数，得到fmo1/。,细胞，或受体分子数/1（）6细胞（IfnIO1=6.04XIO个分子）。2.多点饱和曲线法求受体的量和亲和力1） 试剂：以膜受体为例。选定的标记配基、测定NSB

14、的非标记配基、待测标本的膜蛋白均用选定的缓冲液稀释，并经预试验选定各自的浓度范围。2） 加样步骤：全部做双复管，各总结合TB管（6-8管义2）加浓度逐步递增的标记配基，平行的NSB管（3-4管X2）另加非标记配基，最后加一定量膜蛋白，反应总体积全部用缓冲液补足至一定量。3） 温育和分离：各反应管在一定温度振摇温育一定时间（通过预实验选定），立即通过多头细胞收集器用冰冷缓冲液终止反应，迅速抽滤至两层玻璃纤维膜上，并以IOm1冰水淋洗。滤膜80C30min烘干，投入闪烁液内作固相测量。另取一定体积测定蛋白含量。4） 数据处理SCatChard作图法：根据质量作用定律，当反应达到平衡时，k1R1=k

15、2R1,因为R=RT-R1,k2k1=KD,所以从式1可得到SCatChard函数：强=四1KDKD可以看出，若以R1为自变量（横坐标），R11为因变量（纵坐标），应是一直线，其斜率是1/KD,横截距就是RT。所以可先将各实验点的实测值减去相应的NSB,再换算成fmo1,然后进行直线回归（简单的计算器便可完成），得到RT和KD。SCatChard作图法因为坐标换算，低剂量区误差被放大，所以用来求RT及KD并不是很好的办法，目前它的用处主要是发现正、负协同以及不属于简单单位点的情况。其它直线化方法，如1ineWeaVerBurk函数、TVOOIf函数等，也有类似缺点。计算机直接曲线拟合：上述式（3）展开、重排，就得到饱和曲线的直接表达式：R12R1RT+1T+KD+RT1T=O（4）该式是二次方程，直接代表饱和曲线，不能用人工或简单的计算器拟合，但是用计算机拟合很方便。可以用一般的最小二乘法，也可用稳健回归法。RT和KD是待求参数，1T是自变量（横坐标），R1是因变量（纵坐标）。拟合时先减去相应的NSB,将CP1n换算成fmo1,然后将各实验点的1T和R1代入式4,拟合求出RT和KD。3.单位点竞争法一定浓度的受体标本和一定浓度饱和区标记配基起结合反应，同时在该