新型冠状病毒2019nCoV核酸混采样本检测标准操作规程.docx

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1、1.检验目的体外定性检新型冠状病毒(2019-nCoV)ORFlab和N基因，用于新型冠状病毒感染的体检筛文件名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸混采样本 检测标准操作规程文件编号PLA63750-S0P-007版本/修订号D/0编制人审核人批准人生效日期查。2.检测原理与方法对新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF Iab及编码核衣壳蛋白N基因的特异性保守序列为靶区域， 进行了双靶标基因的设计,配以PCR反应液,在荧光定量PCR仪上,应用实时荧光定量RT-PCR 检测技术,通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。PCR检测体系包含有内源性的内标引物和探针,通过检测内标是否正常来监测样本采

2、集、提 取过程,避免假阴性结果。3.职责保证分子生物组实验室对于新型冠状病毒(2019-nCoV)筛查检测结果的可靠性。4 .性能特征4. 1准确性检测企业阳性参考品,结果均为阳性。4. 2特异性本试剂盒与冠状病毒(NL63, HKUl,229E,0C43) SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流 感病毒、乙型流感病毒YainagaIa型、Victoria型、甲型HINl流感病毒、甲型H3N2流感病 毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C 型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、肠病毒A、B型、肠病毒C型 (EV-

3、C95).肠病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球 菌、鲍曼不动杆菌、肺泡子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞 菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、 肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、 非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人 类基因组DNA等阳性样本无交叉反应。检测企业阴性参考品均为阴性。4. 3精密度批内精密度Ct值的变异系数(CV,%)W5%.4.4最低检测限本试剂盒最低检测限为200 copies

4、/mLo5.标本类型及要求5.1 样本类型:咽拭子、肺泡灌洗液。5.2 样本采集：5.2. 1咽拭子：用1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头 浸入含L 5ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部 弃去，旋紧管盖。5. 2. 2肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌 段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30 50 InL总量10025OmL不应超过300ml。5 . 3样本灭活：将样本保存管置于金属浴56。C以上保持30分钟。5.4样本保存和运送:待测样本可

5、立即用于处理,能在24小时内检测的标本可置于4保存； 24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存（如无-70保存条件,待测样本可于 -20保存10天,核酸样本-205保存15天）。应避免反复冻融。样本运送采用冰壶加冰或泡 沫箱加冰密封进行运输。6 .标本包装和运输6. 1标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。6. 2所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注 明样本编号、种类、姓名及采样日期。6. 3将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。样本包装要求要符合危 险品航空安全运输技术细则相应的标准。6. 4涉及外部标本运输的，

6、应根据标本类型，按照A类感染性物质进行三层包装。7 .试剂和仪器7. 1试剂：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）7. Ll试剂来源：湖南圣湘生物科技有限公司7. 1.2试剂组份：序号试剂名称规格与装量主要成分12019-nCoV-PCR-反应液624L/管引物(4. 62%)、探针(LI5%)、dNTPs(3. 85%)、MgC12 (0.77%)Rnasin(0. 48%)、PCR buffer(89. 13%)22019-nCoV-PCR-酶混合液96 L/管RT 酶(62. 5%)、Taq 酶(37. 5%)32019 - nCoV-PCR-阳性对照500 UL

7、/管含目标基因（ORFlab、N基因）、内标基因 片段（RnaSe P）的体外转录RNA42019 FCoV-PCR-阴性对照500 UL/管生理盐水7. 1.3开启所有试剂需注明口期及签名。每个试剂盒都应贴有下列标签：物质名称、批号、特 殊储藏说明、开盖人、开盖日期、开盖后有效期。开启时应检查试剂是否变色，是否有肉眼 可见的细菌生长迹象、浊度、沉淀反应等，这些表示已经变质或超过保质期。7.1. 4试剂应避光密闭,试剂组分保存于-205。7.1.5生产口期,失效口期请见外包装盒。不使用时,这些试剂在包装标识的效期内可稳定存 放。一旦使用,扩增试剂盒反复冻融应不超过3次。7. 2仪器：适用于上海

8、宏石SLAM 96荧光PCR仪。8.环境和安全控制8. 1检测环境：PCR实验室条件达到生物安全二级及以上。8. 2安全控制：8. 2.1检验人员个人防护应达到生物安全三级，至少穿戴工作服、一次性工作帽、双层手套、 医用一次性防护服、医用防护口罩（N95及以上）或动力送风过滤式呼吸器、防护面屏或护 目镜、工作鞋或胶靴、防水靴套。必要时，可加穿防水围裙或防水隔离衣。根据目前实验场 地设置要求，个人防护设备在试剂配置区缓冲间进行穿戴齐全后再进入核心工作区。8. 2. 2避免过度劳累，并及时对其健康情况进行监测，注意监测自身及身边检验人员体温和 呼吸系统症状。8. 2. 3防护装备脱卸的注意事项：脱

9、卸时尽量少接触污染面。脱下的防护眼罩、长筒胶鞋等 非一次性使用的物品应直接放入盛有消毒液的容器内浸泡；其余一次性使用的物品应放入黄 色医疗废物收集袋中作为医疗废物集中处置。脱卸防护装备的每一步均应进行手消毒，所有 防护装备全部脱完后再次洗手、手消毒。8. 2. 4如果操作人员的皮肤或衣物上沾到了血液及废液，应立刻用清水冲洗并进行消毒处理。 如果眼睛被溅入血液及废液，用大量的清水冲洗并采取必要的医疗措施。8. 2. 5工作台在每天工作结束后用10%的次氯酸钠溶液清洗，空间用紫外线照射60分钟。8. 2. 6此试剂为体外用，试剂含有防腐剂和稳定剂，存在一定的危险性；不要入口，避免和 眼睛，皮肤或衣

10、服接触。8. 2. 7医疗废物处理：本检测所产生的全部废弃物均应按安全手册中有关规定执行并遵 循医疗废物管理条例和医疗卫生机构医疗废物管理办法的要求，规范使用双层黄色 医疗废物收集袋封装后按照常规处置流程进行处置。9.操作步骤9.1 试剂准备（在试剂准备区进行）；9.1.1 取出盒中的各组分,室温放置,待其温度平衡至室温后,混匀后备用；9.1.2 根据待测样本数量,阳性对照和阴性对照数量,按比例（2019-nCoV-PCR反应液26L / 人份+ 2019-nCoV-PCR-酶混合液4L /人份）取相应量的组分,充分混匀成PCR混合液,瞬时 离心后备用；9.1.3 将上述准备好的试剂转移至样本

11、处理区，待用。9. 2样本处理（在样本处理区进行）9. 2.1新型冠状病毒2019-Ncov磁珠法提取核酸检测（混采样本）使用SlO015核酸提取或纯化试剂盒提取核酸9.2. 1. 1按照SlOoI5-洗涤液2标签指示，使用前加入相应量的无水乙醇。9. 2. 1.2根据样本数量，将蛋白酶K （20L人份）和SIoOI5-磁珠溶液（30L人份）按照比 例混合成蛋白酶K-磁珠混合液，震荡混匀，低速瞬时离心。9. 2. L 3根据待测样本数量取L 5ml离心管若干，每管加入300L样品，每一次实验同时检 测一份弱阳性对照、一份阳性对照、三个阴性对照；9.2. 1.4加入500LS10015-提取溶液

12、1和50L蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀 30s,60C 加热 IOmin.9. 2. 1,5室温静置Imirb低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后吸弃废液（注 意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）：9. 2. 1.6加入700LS10015-洗涤液1,震荡混匀30s,低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性 分离器。磁吸3min,将液体完全吸出丢弃（注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）；9. 2. 1.7加入700LS10015-洗涤液2,震荡混匀30s,低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性 分离器。磁吸3min,将液体完全吸出丢弃，继续于磁性分离器上静置2min,将液体完全吸尽。

13、（注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠；若此时洗涤液并非无色透明，需重复该步骤）；9. 2.1.8室温开盖静置5min （乙醇残留会对后续实验造成不良影响，需保证乙醇充分挥发； 同时不要干燥太长时间，以免磁珠挂壁难以洗脱）。9. 2. 1.9加入60LS10015-洗脱液S,震荡混匀30s,将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置 5min；低速瞬时离心将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min,然后将洗脱下来的核酸转移 到干净的1.5mL离心管中。9.2. 1.10根据样本数量，取相应量的八连管，各管分别加入提取好的待测标本、阴性对照、 阳性对照及弱阳性对照各20L,将30L配制好的PCR-混合液加入

14、到装有20L核酸的PCR 扩增管中，盖好八连管盖。9. 2. 3将上述准备好的八连排转移至扩增区处理区,准备上机扩增。9 . 3 PCR扩增9.1.1 1确定UPS工作状况正常后启动控制电脑，开上海宏石SLAN 96P电源开关，打开电脑并双 击桌面“SLAN 8.2.2”图标，打开软件。9.1.2 项目创建：首次操作需要进行项目创建，在软件最上方的项目栏点击项目创建，以后使 用时就只需要调用相应项目程序就可以了。选择荧光检测通道选择：D选择FAM（ORFTab区域） 和ROX （N基因）通道检测2019-nCoV病毒核酸；2）选择HEX通道检测内标，设定循环参数完 成创建实验项目。循环参数：步

15、骤温度时间循环数1逆转录50o C30分钟12cDNA预变性95o C1分钟13变性95o C15秒45退火,延伸及荧光采集60 C30秒4仪器冷却250 C10秒19.3.3完成项目创建后，点后Yhome ”进行基本芯上置，弹出的对话框中编场E所创建的项目名称+样本号+日期，实验名称以及保存到相应的文件夹下，点击“孔板编辑”选择实验需要运 行模块，选择项目程序，选择“实验分析”模块下点击开始运行扩增程序。9.3.4 样本信息编辑将：将阳性对照、阴性对照及待测样本的点样顺序设置并设置样本 名称和实验项目。9.3.5 实验结果分析：反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行 分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实 际情况自行调整，Start值可以在315、End值可设在5 20,调整阴性对照的扩增曲线使其 平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析,使各项参数符合下述力0质量控制”中的要求， 然后到PIate窗口下记录定性结果。点击软件界面上方文件的下拉菜