曲霉核酸检测试剂注册审查指导原则（征求意见稿）.docx

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1、曲霉核酸检测试剂注册审查指导原则（征求意见稿）本指导原则旨在指导注册申请人对曲霉核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门提供参考。本指导原则是对曲霉核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括审评审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。本指导原则是在现行法规和

2、标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，相关内容也将适时进行调整。真菌的生物分类包括门、纲、目、科、属等，本指导原则对真菌的分类描述如无特殊说明均为“种”，如指“目”或“属”等均已在原文中明确。一、适用范围本指导原则适用于采用实时荧光PCR法，对肺泡灌洗液、痰液、组织样本等中的曲霉核酸进行体外定性检测的试剂，包含曲霉菌属（ASPergIuC通用型核酸检测试剂和曲霉菌属中一个或多个菌种的检测试剂。检测结果临床上用于肺曲霉病的辅助诊断。对于采用其他方法学的曲霉核酸检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述内容不够全面，申请人应参照本指导原则，根据产品特性对

3、适用部分进行评价，并补充其他的评价资料。本指导原则适用于曲霉核酸检测试剂注册申请和变更注册申请的情形。本指导原则针对曲霉核酸检测试剂注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家药品监督管理局公告2023年第122号）等相关法规的要求，同时建议参考定性检测试剂分析性能评估注册审查指导原则等适用的技术文件要求。二、注册审查要点（一）监管信息1产品名称及分类编码产品名称应体现检测目标病原体，如曲霉核酸检测试剂盒（实时荧光PCR法）、烟曲霉菌核酸检测试剂盒（实时荧光PCR法）等。该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为68

4、40o2.其他信息还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。（二）综述资料综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。应详细说明产品所采用的技术原理及检测流程。明确产品检测靶基因，提供引物和探针的设计依据。提供核酸提取（手工和自动提取方式应分别明确）和PCR扩增的时间，提供不同适用机型的检测通量（如适用）。与已上市同类产品或前代产品进行比较，比较内容包括样本类型，检测原理，检测靶基因，组成成分，内标，质控品，判读规则，分析性能和临床性能等。提供样本类型选择的依据。提供产品预期用途和临床适应证，明确适用人群的情况。（三）

5、非临床资料1分析性能研究分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。研究中采用的曲霉阳性样本，应采用科学合理的方法确定其阴阳性和浓度水平，提交具体的试验资料，并明确培养和鉴定结果。分析性能评估用样本均应采用真实样本，如涉及稀释后检测，应采用与适用样本类型一致的阴性基质。也可采用人工构建样本（如质粒）进行研究，此部分研究可作为额外研究资料提交注册。对于各项性能中采用的样本，在下述各项性能研究资料中分别提供样本信息列表。检出限和包容性研究中所用样本应相互独立。1.1 样本稳定性应对样本稳定性进行详细研究，包括采集后未经处理的样本，加入

6、不同裂解液/消化液的样本，灭活处理后的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。如产品适用不同的样本类型，应对每种样本类型进行稳定性研究。如核酸提取液可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。1.2 企业参考品验证根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。13精密度应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的

7、检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。采用培养菌株进行精密度评价，应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：阴性样本：不含待测物，阴性检出率应为100%(220)。临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应95%(n20)o中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且Q值的CW5%(n20)o1.4 包容性1.4.1 采用生物信息学方法对产品检测的包容性进行研究，研究应覆盖已公布的曲霉核酸序列。1.4.2 根据试剂盒检测范围选择进行包容性验证的曲

8、霉菌种，使用具有不同时间和区域特征性的不同来源的临床样本或培养菌株进行验证，每种菌种至少使用3例样本，研究应包括检出限和重复性的验证。对于曲霉菌属通用型核酸检测试剂，样本应覆盖已知曲霉菌属中的主要致病菌种，至少包含烟曲霉菌(A加加gQ，s)、黄曲霉菌(Af1avus)、黑曲霉菌(A.niger)、士曲霉菌(Aderreus)、构巢曲霉菌(A.nidu/anS)、图宾根曲霉菌(Adubingensis)、米曲霉菌(A.oryzae)、聚多曲霉菌(A.sydowii)、杂色曲霉菌(Aeersico1or)、亮白曲霉菌(A.Candidus)、灰绿曲霉菌(A.g1aucus)。1.5 检出限根据试剂

9、盒检测范围选择进行检出限验证的曲霉菌种。如为曲霉菌属通用型核酸检测试剂，应至少对烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、士曲霉菌、构巢曲霉菌分别进行检出限的确定和验证。1.5.1 检出限的确定建议使用培养菌株系列稀释于与适用样本一致的阴性基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度重复检测，记录不同浓度检出的结果，采用适当的模型(如Probit分析)和分析方法，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。建议申请人采用抱子m1作为菌株浓度的表示方式。除此之外，申请人还应采用数字PCR、标准曲线(通过标准物质或构建质粒绘制标准曲线)等方法进行菌株核酸浓度的确认，以COPieSm1作为毒株浓度的表示方式

10、。应明确每份菌株的来源、浓度、制备方法等信息。152检出限的验证建议使用至少5份不同来源的最低检测限水平的培养菌株，进行至少20次的重复验证，阳性检出率不低于95%。注册申请人应能够提供用于最低检测限验证的各个菌株的来源、制备方法及浓度等信息。16分析特异性1.6.1 交叉反应1.6.1.1 交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面：近缘菌、易引起相同或相似的临床症状微生物、感染部位附近的定植菌等，研究样本具体见表1。161.2建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106cFUm1或更高,病毒为105pFUm1或更高。1.6.1.3申请人应提供所有用于交

11、叉反应验证的微生物的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。表1需进行交叉反应研究的病原体曲霉烟曲霉菌(A.fumigatus)、黄曲霉菌(A.f1avus)、黑曲霉菌(A、米曲霉菌(.A.oryzae)、土曲霉菌(AJe/Teas)、构巢曲霉菌(A.nid忧IanS)(选择检测范围外的曲霉菌种)其他真菌毛霉菌目(MnCondeS)常见菌种(35种)、念珠菌属(Ccmdida)常见菌种(35种)、赛多泡霉(Scedosporiutnapiospermun)、耶氏肺抱子菌(Pneumocystisjirovecii)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、马尔尼菲篮状菌(Ta

12、1aromycesInarn哂ei)、镰刀菌属QFusariuin)(23种)、青霉菌属(PeniCi11iUm)常见菌种(2种)细菌肺炎链球菌(StrePtOCOCCUSPneUmOniae)、流感嗜血杆菌(Haemophi1usinf1uenzae、铜绿假单胞菌(Pseudoinonasaeruginosa)、肺炎克雷伯菌(K1ebsie11apneumoniae)、卡他莫拉菌(Morcixe11aCatarrha1is)、金黄色葡萄球菌(Staphy1ococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(ACinetObaCterbaumannii)、大肠埃希菌(ESCheriChiaco1i,E

13、.co1i)1.6.2干扰试验应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的曲霉样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的。值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。用于干扰试验研究的物质具体见表2。表2用于干扰试验研究的物质类别具体物质内源物质痰液和肺泡灌洗液：血液、唾液、粘蛋白、白细胞等活检组织：血液、粘蛋白、白细胞等抗真菌药物两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净、三嗖类（伏立康嗖、伊曲康嘎、泊沙康嗖、艾沙康哇）、氟胞喀唆等其他抗菌

14、药左氧氟沙星、阿奇霉素、头泡曲松、美罗培南、利福平、异烟辨、阿莫西林等吸入药物硫酸沙丁胺醇、肾上腺素等麻醉药盐酸利多卡因等样本采集和处理期间引入的物质（二硫苏糖醇、NaC1等）17核酸提取/纯化性能在进行核酸检测之前，建议有核酸提取/纯化步骤。该步骤的目的为有效破环真菌细胞壁，分离出目的核酸，并应具有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。研究确定核酸提取方法，阐述核酸提取原理，提交提取方案选择研究资料。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂至少进行抗干扰

15、、再现性和检出限的验证，如果配套核酸提取试剂提取原理存在差异，还需额外进行检出限的建立研究。1.8反应体系1.8.1 样本采集和处理1.8.1.1 样本采集方式的选择和样本采集量的要求。1.8. 12样本采集时间点的选择：是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。18.13样本处理方式的选择:研究样本适用的灭活方式,消化方式（如适用）、保存方式，包括样本用量、保存温度、时间等。1.8.2核酸提取和反应体系研究确定最佳核酸提取和反应体系，包括核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。提交不同适用机型基线和阈值循环数的确定资料。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。2 ,稳定性研究申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括具体的实施方案、详细的研究数据以及统计分析结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。3 .阳性判断值研究阳性判断值确定资料主要指对申报产品核酸检测的Ct值，即结果判断的临界值进行确认的资料。阳性判断值研究样本来源应为预期人群，如临床需要进行肺曲霉病