金钱白花蛇药材检验操作规程（2023版）.docx

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1、金钱白花蛇药材检验操作规程（2023版）【性状】本品呈圆盘状，盘径36cm,蛇体直径0.20.4cm0头盘在中间，尾细，常纳口内，口腔内上颌骨前端有毒沟牙1对，鼻间鳞2片，无颊鳞，上下唇鳞通常各为7片。背部黑色或灰黑色，有白色环纹4558个，黑白相间，白环纹在背部宽12行鳞片，向腹面渐增宽，黑环纹宽35行鳞片，背正中明显突起一条脊棱，脊鳞扩大呈六角形，背鳞细密，通身15行，尾下鳞单行。气微腥，味微咸。【鉴别】聚合酶链式反应法。模板DNA提取取本品0.5g,置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取50mg,置2.0m1离心管中，加入提取缓冲液2001（含1%聚乙烯毗咯烷酮-40和1%曲拉通X-

2、100的0.5mo11氢氧化钠溶液），充分混匀；加入O.1mo1/1Tris-盐酸溶液（pH8.0）8001,混匀，离心（转速为每分钟12000转）5分钟；将上清液5001转移至另一离心管中,加入0.1mo11TriS-盐酸溶液（pH8.0）5001,混匀，离心（转速为每分钟12000转）5分钟；将上清液50转移至另一离心管中，加入无菌双蒸水450可，混匀，作为供试品溶液，置一20C保存备用。另取金钱白花蛇对照药材0.5g,同法制成对照药材模板DNA溶液。PCR反应鉴另U弓I物：5,GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3,5GGAATCTTATCGATATCTGA

3、ATTAGTA3,oPCR反应体系：在200HI离心管中进行，反应总体积为251,反应体系包括10PCR缓冲液2.51,dNTP（10mmo11）11,鉴别引物（10mo11）各0.21,TaqDNA聚合酶（51）0.21,模板DNA11,25%聚乙烯毗咯烷酮-40溶液11,10mgm1牛血清蛋白0.51,无菌双蒸水18.4将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95C预变性5分钟，循环反应30次（95C30秒，60C45秒），延伸（72C）5分钟。电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541）,胶浓度为1.5%,每IOOrnI胶中加入IOOOoX核酸凝胶染色剂GeIRed51;供试品与对照药材PCR反应溶液的上样最分别为51,以D12000（DNA条带从小到大分别为100bp,250bp,500bp,750bp,IOOObp和200ObP）作为DNA分子量标记，进行凝胶电泳检测。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在500750bp之间应有单一DNA条带，空白对照无条带。【浸出物】照醵溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于15.0%。