与干旱响应基因表达相关的拟南芥转录因子DREB2A功能分析.docx

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1、与干旱响应基因表达相关的拟南芥转录因子DREB2A功能分析摘要转录因子DREB1A/CBF3和DREB2A特异性地与顺式作用干旱响应元件和C串序列(DRECRT)相作用，这两个元件与拟南芥的冷和干旱胁迫响应基因的表达相关。在正常条件下全长DREB2A不能激活下游基因表达，显示了DREB2A蛋白需要转录后修饰才能活化，但是该机制尚不清楚。通过对拟南芥原生质体中的DREB2A蛋白进行功能域分析，我们鉴定出254和335之间的残基区是个转录激活域，而且删除136到165之间的残基可使DREB2A蛋白转化成一个组成型活化形式。该组成型活化的DREB2A蛋白的过表达可使得拟南芥对干旱胁迫具有显著的耐受，

2、但对冷冻仅轻微耐受。微阵列和RNA凝胶杂交分析表明DREB2A调节许多水胁迫诱导基因的表达。然而DREB2A下游的一些基因并不是DREB1A的下游基因，尽管DREB1A也识别DRE/CRT元件，但该蛋白却调节冷胁迫响应基因的表达。在非胁迫条件下，绿色荧光蛋白与组成型的DREB2A构成的融合蛋白强烈定位于细胞核而其与全长DREB2A构成的融合蛋白在细胞核中的定位信号微弱。DREB2A的136到165的残基区对该蛋白在细胞核中的稳定及活化具有重要作用。引言植物的生长发育受各种非生物胁迫的影响，如干旱，高盐及低温。植物在生理和生化水平上响应和适应这些胁迫。而且，许多参与胁迫耐受的基因在胁迫条件下被诱

3、导表达。这些胁迫诱导基因大部分由脱落酸(ABA)控制，然而有些并非如此。该情况表明在胁迫响应基因表达中存在脱落酸依赖和脱落酸非依赖的调控途径。几个胁迫诱导基因，如RD29和CORI5A,是通过脱落酸非依赖的途径被诱导的。一个9碱基(TACCGACAT)的保守序列被定义为干旱响应元件(DRE),该元件是一个顺式作用元件，在脱落酸非依赖响应干旱、高盐和冷的途径中参与RD29A诱导的调节。相似的顺式作用元件，如C串序列(CRT)和低温响应元件，都含有组成DRE序列核心区的A/GCCGAC基序，这两个元件调控冷诱导基因的表达。利用酵母单杂交技术可分离得到编码DRE结合蛋白(CBF1,DREB1A和DR

4、EB2A)的三个CDNA序列。在保守的DNA结合域(该结合域是在ERF/CRT蛋白中发现的)中，这些蛋白显示具有显著地序列相似性。在拟南芥中这些蛋白特异性地结合DRE/CRT序列且激活由DRE/CRT驱动的基因的转录。我们分离了与DREBIA同源的两个cDNA克隆(DREBIB和OREB/C)和一个与DREB2A同源的cDNA克隆(OR828)。Gi1mOUr等(1998)也报道了来自拟南芥的两个CBFJ同源基因，CBF2和CBF3。CBF1与DREB1C一样，而其它的两个同源基因CBF2和CBF3也分别与DREB1C和DREBJA一样。冷胁迫(而不是干旱和高盐胁迫)诱导。REB/CB/基因的

5、表达。相反，OREB2基因的表达受干旱或高盐胁迫的诱导。DREBI/CBF和DREB2蛋白都能结合DRE/CRT,但是DREBI/CBF蛋白在诱导冷胁迫基因的表达中行使功能而DREB2蛋白参与干旱响应基因的表达。最近，SakUma等(2002)报道了三个新的ORE5/C3/相关基因，这些基因在各种胁迫条件下的表达量并不高。然而，其中一个基因即C3F4QAEB7。可被渗透胁迫所诱导，另外两个，DDFDREBIF和DDF2DREB1E可被高盐诱导,这些情况表明DREB1/CBF和DREB2蛋白调控信号途径存在交叉。在正常生长条件下，烟草花叶病毒(CaMV)35启动子驱动的DREB1/CBF的过表达

6、可引起拟南芥植物的生长抑制和对干旱、高盐和冻害的耐受增强，这种情况表明在冷胁迫响应基因表达中DREB1/CBF蛋白不需要进行修饰就能行使功能。通过CDNA和基因芯片技术已经鉴定出了DREB1/CBF蛋白下游40多个受调控的基因。它们的许多蛋白产物潜在地响应转基因植物的胁迫耐受。这些下游基因也诱导一些基因的表达，这些基因编码诸如C2H2锌指类和AP2/ERF类的转录因子，说明DREDREB1(CRTCBF)调节子调控的基因表达下游存在进步的调节过程。我们分析了直接受。划力/基因调控的下游基因的启动子区的保守序列，在启动子区-51和T5残基间发现了A/GCCGACNT的保守的DRE序列。DREB的

7、同源基因在各种物种中都有报道，包括单子叶和双子叶植物，例如油菜(Brassicanapus)番茄(So1GHIycopersicum)、大麦(HOrdeImvu1gare)、玉米(ZeQmays)大米(Ofyzasativa)黑麦(SeCHeCeWHe)和小麦(7icaestivm)o这些基因的表达可使得那些植物对冷胁迫耐受。DREB2蛋白也含有个保守的ERFAP2DNA结合结构域并且能识别DRE序列。通过对拟南芥全基因组序列数据库进行搜索，我们发现除了DREB2A和DREB2B之外至少还有六个DREB2同源体。DREB2A和DREB1B基因可被干旱和高盐强烈诱导，而其他的则不会。另外，其他六

8、个。RE32同源体在胁迫条件下表达水平很低。因此，在这八个DREB2类蛋白中，DREB2A和DREB2B被认为是在干旱和高盐胁迫条件下行使功能的主要的转录因子。然而，DREB2A基因在转基因植物中的过表达既不引起植物生长抑制也不提高其胁迫耐受力，这表明DREB2A蛋白需要进行转录后修饰，例如磷酸化才能使其活化，但是该活化机制目前尚不清楚。在本研究中，我们对DREB2A蛋白的功能域进行分析，发现其C末端区具有转录激活域而且它的中间区域作为负调节域在DREB2A活性的调节中具有反作用。我们通过删除这个负调节域成功构建了一个具有组成型激活形式的DREB2A35EHoctorP1k1sGBDRE82AES-I10A14-BD(GB)GM4-A0III13680G8-GA14-ADGBDREB2A2S433SGB*OREB2AGBMeB2A0D-0RE82A2S2317TIHGB-ORCB2A13M3113W35GMAeB2AG8-0REB2A31335GBORC82AG-0AS62A254-21DRE2ACAF*2Trarwcrp1oviActvtton6tMRgnMB2ARed9MGM4Bmq将254到335之间的氨基酸区划分成三部分以用来分析并鉴定DREB2A的