Western blot步骤实验蛋白提取及定量相关试剂配制电泳转膜及显色过程全.docx

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1、Westernb1ot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程（碧云天试剂盒）一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA（也称ge1shift）,footprinting等。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（NUCIearandCytop1asmicProteinExtractionKit）提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提

2、细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于WeSten1,EMSA,footprinting,报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B,在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。二、注意事项1. 需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。2.

3、 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4进行。3. 本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。4. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒（PoOO9P0010POOIOS/P0011/PoOI2/P0012S）测定蛋白浓度。但不适合用BradfOrd法测定蛋白浓度。5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。三、使用说明1准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为

4、ImM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为ImM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍）2 .对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%处理5min）处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心（1400r/min5min）收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3 .对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。4 .每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。（对于二百万He1a细胞，

5、其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。）5 .最高速剧烈涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间。）（时间可稍长，保证细胞破碎）6.冰浴10-15分钟。7.加入细胞浆蛋白抽提试剂BIo微升。最高速剧烈VOrteX5秒，冰浴1分钟。8.最高速剧烈Vortex5秒，412,000-16,000g离心5分钟。9 .立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。（千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。）10 .对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋

6、白抽提试剂。（不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。）11 .最高速剧烈VorteXI5-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。12 .412,000-16,000g离心C分钟。13 .立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70冻存。14 .对于新鲜组织：A,把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B（例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B）o并加入PMSF至最终浓度为ImM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入20

7、0微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4进行。B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。C.41,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。（吸上清时千万不要触及沉淀。）D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。第二部分蛋白定量BCA法（南京建成试剂盒）一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混

8、匀器、37水浴箱（气浴箱）、可见分光光度计（562nm）二、适用范围：本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清及植物等样本中的蛋白含量。三、试剂组成及配制试剂一：粉剂2支、稀释液12.5m12瓶试剂一应用液的配制：取试剂一粉剂1支与试剂一稀释液1瓶混匀，溶解完全后4度待用。试剂二：250U12支工作液的配制：按试剂一应用液：试剂二二50:1的比例配制，混匀后待用，用多少配多少。试剂三：终止剂储备液20m11瓶终止剂应用液：取终止剂储备液用双蒸水5倍稀释后备用，4度冷藏试剂四：563ug/m1蛋白标准液0.2m11支，4度保存1个月（可分装20冷冻）四、操作步骤：1、样本前处

9、理：、动物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积（m1）=19的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液，待测。、植物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积（m1）=19的比例，加入9倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500转/分，离心10分钟，取上清液，待测。、血清（浆）样本：按血清（浆）：生理盐水=1：49的比例稀释，待测。、其它液体样本：按比例稀释，测定范围为202000Hgm1,（不同的样本稀释度不一样），请在批量测试前先做12个样本的预实验。2、操作表：空白管标准管测定管双蒸水（UI）2000563Ug/m1标

10、准品0200(1)待测样本（UD0020工作液（P1）250250250漩涡混匀，37孵育30分钟终止剂应用液（1）750750750漩涡混匀，静置5分钟，562nm波长，水调零，0.5cm光径测各管OD值五、计算公式：总蛋白浓度测定。值-空白。值标准品浓度样本测定前（g/mD一标准。值-空白OO值（563gm1）稀释倍数六、测定原理：碱性条件下，蛋白将C/+还原为C1,Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，562nm处有最大吸收峰，依据吸光度与浓度成比例，通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。七、检测范围检测浓度下限达到20ugm1,最小检测蛋白量达到0.5Ug,在202000ug/m1浓度范围

11、内有良好的线性关系。标准曲线范围：标准品浓度（g/m1）绝对OD值0-25000-0.499第三部分Westernb1ot相关试剂配制A. 30%聚丙烯酰胺储备液(ACr/Bis)：丙烯酰胺(Acr),29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BiS),1g,去离子水溶解，37水浴助溶，定容至IOom1。0.45Hm滤器过滤，棕色瓶4C避光保存。B. 10%十二烷基硫酸钠(SDS)：SDS,10g；H2O,80m1。68加热溶解，浓HC1调PH至7.2,定容至IOOm1,室温保存。C. 10%过硫酸锭(AP)：AP,1g；H20,IOm1o避光，4保存。(42周)D.分离胶缓冲液(1.5MTris-H

12、C1pH8.8):Tris,18.17g；H2080m1o用浓HCI调PH至8.8,定容至100m1,4保存。E.浓缩胶缓冲液(1OMTris-HC1pH6.8):Tris,12.11g；H2O80m1)用浓HCI调PH至6.8,定容至100m1,4保存。F.电泳缓冲液(10):甘氨酸(G1ycine),188g；Tris30.2g；SDS,10g；H2O,800m1o调节PH至8.3,定容至I1,4保存(用时稀释为IX)。G.5SDS-PAGE1oadingBuffer(5m1)：IMTris-HC1(pH6.8),1.25m1；SDS,0.5g；漠酚蓝(BPB),25mg；甘油，2.5m1

13、；加去离子水定容至5m1。充分混匀，分装成5001份，室温保存。使用前每份加入251B.筑基乙醇(2-ME),加入2-ME的1oadingbuffer可在室温下保存一个月左右。H.考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存I.考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250,250mg;甲醇，45m1；冰醋酸，10m1；H2O,定容至100m1。室温保存。J.考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100向;乙醇，50m1；dH2O850m1,充分混合,室温保存K.膜转移缓冲液:甘氨酸,2.9g；Tris,5.8g；SDS,0.37g；加H20600m1充分溶解，加20Om1甲醇，混匀，定

14、容至11,室温保存。L. TBS缓冲液：NaC1,8.8g；IMTis-HCUpH8.0),20m1,加入约800H20搅拌溶解，定容至I1,4C保存。M. TBST缓冲液:NaC18.8g；1MTis-HC1(pH8.0),20m1,加入约800H20搅拌溶解，加入0.5m1Tween20后充分混匀，去离子水定容至11,4保存。N. IMTis-HC1(pH8.0)：Tris121.1g置于I1烧杯，加入约80Om1去离子水,充分搅拌，加入浓HC1约42m1,定容至11,高压灭菌，室温保存。第四部分Westernb1ot电泳、转膜及显色过程1、清洗将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。封

15、板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。2、制胶SDS-PAGE分离胶配方表(12%GeI)各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(m1)IOm115m120m1H203.34.96.630%Acry1amide4.06.08.01.5MTris-Hc1(pH8.8)2.53.85.010%SDS0.10.150.210%过硫酸筱(AP)0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008SDS-PAGE浓缩胶(5%ACry1amide)配方表各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(m1)廿H汨Z彳小4m15m16m1H2O2.73.44.130%Acry1amide0.670.831.01OMTris-Hc1(pH6.8)0.50.630.7510%SDS0.040.05