全面裂解液作用经典.docx

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1、1、核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化那么是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盆及其它杂质彻底别离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDSsTritonX-100,NP-40、Tween20等）和盐（如Tris、EDTA.NaCI等）。盐的作用，除了提供个适宜的裂解环境（如Tris）,还包括抑制样品中的核酸溶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸构造的稳定（如NaCD等。去污剂那么是通过使蛋白质变性，破坏膜构造及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能参加蛋白的：利用

2、蛋白的将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白般的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸,也有百接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GITxGuHCI等）裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流,却不是基因组DNA抽提的主流。最常用的纯化方法，-是PC抽提+静沉淀，二是介质纯化.第一种方法是利用PC对裂解体系进展反更抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白侦的别盅：再用熔将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的别离.第二种方法那么是利用某些固项介质，在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的别离.高盐沉淀去除蛋白战是第一种纯化方法的一个变体,省略了PC操作的麻烦.

3、当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR,其它杂质一如多相、多的等-的去除，根本上都是在这两种方法的根底上，通过增加一些特别的试剂，或者嫡加一些额外的步骤来实现的“2、了解你的实验样品如果你研究某个实验样品.并且要抽提它的核酸,以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、筋含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知,当样品稍微有一点笈杂时,抽梃核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA.怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。

4、绝大局部情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果.对一些杂质含IIt高的样品,如果使用新鲜样品抽提基因组DNA是碰到杂质残留过大的问题,可以试下-20C保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果.样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液技好只保存有核细胞：将样品分割后保存，防止反复冻融.如果实验室不具备适宜的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择.3、裂解方法的评价含蛋白牌的裂解方法，可以认为是抽提基因组DNA的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA相连接的蛋白质的游离,蛋白曲的作用是使蛋臼质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA是

5、很容易“舞”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白前消化变小后，那么不容易被基因组DNA”维住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组DNA的纯度更高。另外个思路是，如果基因组DNA与蛋白质S缠”在起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组DNA的特性占优势，那么纯化时以DNA的形式被保存下来，导致蛋白质的残招；如果蛋白质的特性占优势，那么纯化时以蛋白质的形式被去除，导致DNA的损失。有小样品，如肌肉，即使是RNA抽提，也强烈建议使用含蛋白溶的裂解液（或者在操作中的某个时候使用蛋白舐消化蛋白质）,原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和坡高纯度的根底。不使用蛋白质

6、的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组DNA抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时.控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些.高浓度蛋白质变性剂（如GIT.GuHCI等）的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提，最术要的是快速裂解细胞膜，至于与塘因姐DNA相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质”缠“住的问8S，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。岛浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞腴，进而迅速抑制住细胞内的RNA制，从而确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该

7、方法的样品-主要是植物，其它绝大局部样品的RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为根底的。该方法也可用于基因组DNA抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的塘因组DNA抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是CTAB的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB的放量对裂解效率有很大的影响，而1,似乎还说不清楚朦因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB.批号不同，效果就可能差异很大.洗涤去除CTAB要比其它的盐雄一些，同时，CTAB的少量残留也会对辞活性有巨大膨胸，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键“裂解时的温度，多使用

8、65C：但如果发现降解严J或者得率太低，可以试一下37C-45C这个相时低温的区域.SDS硬裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无暴因组DNA污染的特点,控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键，蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些，所以，参加溶液IH后在4C静翼段时间以及采用4C尚心去蛋白质，都可以提高质成。该方法不定要使用PC纯化，但结合PC纯化，可以获得纯度很高的质粒，RNA的去除可以靠在溶液I中参加RNaseA（100ugm1）或者在最后的溶解液中参加RNaseA（25ugm1）来实现。总的感觉是，在溶液I中使用RNaseA,RNA的残留少一些。不过，经典沉

9、淀几乎没有方法彻底去除RNA残留。另外，对大质粒（50kb以上），该方法可能会有问题。PCR模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,非常快速。也正因为不纯化,所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简殖的裂解液就是水，笈杂点的就会含有一些不会抑制后续的PCR反响，而旦能提高裂解效率，甚至还可能局部消除样品内抑制PCR反响杂质的东西，如TritonX-IO0、甲醍胺等。再复杂点的就会含有诸如Che1exIOO之类的能吸附局部杂质的介质.操作也非常简小，多使用孤度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者岛温低温的星

10、次循环等。该方法果适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某个样品是阳性还是阴性。降低样品使用珏可以提高阳性率，因为样品量的降低,同时意味着PCR的抑制物址的降低。选择了适宜的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例.这个问题非常IE要，但却没有获得足婚的重视.严市的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如Im1裂解液可以用于Tmg组织或者C个细胞：我的建议是，你的样品出绝对要小于资料所提供的.起始样品用多大，并没有具体的说法.加果不是样品IR有限，那么以能抽提出满足数次成功实脸所需的核酸敢，作为决定样品起始Ift的根底，会比较合理的.不要因为Im1裂解液可以抽提IOOmg样品.

11、就一定使用IoOmg样品.裂解液的用量，外表上与抽提的结果（纯度及得率）没有关系.然而.在实际操作中，对结果是有比较大的影晌的“裂解液的用量原那么是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中,浓度过低，将导致沉淀效率低，膨响得率：浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降.另外，裂解液的用At是以样品中蛋白质的含址为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记.4、钝化方法评饰PC抽提/淋沉淀方法，是一个永不过时的方法。梗定、可军、经济、方便.PC抽提可以彻底去除蛋白版.酌沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品（杂质为蛋白质）,该方法完全可以获得制质数的核酸。虽然每次PC抽提

12、都会损失一局部核酸（因为不可能将水相全部移取）,以及低浓度核酸的肿沉淀效率低,但这些问题都可以弄操作的调整而得以解决或者减少影响.该方法的做大的问题是不适合大规模抽提.PC抽提是去除蛋白侦的一个非常有效的手段.笨酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水料中被折出，处于笨酚中或者苯酚/水相之间.PC抽提的关键是.-要混句彻底，二要用量足够.彻底混句，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白废完全变性.许多人总是担忧混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组DNA造成破坏，实际上大可不必如此小心.剧烈的混匀操作，是会局部打断大分子的基因组DNA.但该破坏作用不会强烈到DNA变成Iokb以内的小片段.手剧烈

13、晃动混匀后，基因组DNA的片段，大局部会大于20kb,这个大小，除了些特别的要求外，对PCR和醉切，都是完全适用的.如果要求的片段非常大，如构建文库用，那么不能使用剧烈的混匀方法，而只能来向温和底倒混句-此时的关键是：裂解液的比例要足够大.使体系不要太粘相.用址要足够，是因为某酚去除蛋白质是有一定的饱和度的.超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被诙去除，必须靠屡次抽提，方可彻底去除.另外，体系太粘稠的害处是，蛋白贷难以彻底去除，以及基因组DNA会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例“4C齿心操作有利于更彻底去除蛋白质.PC抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以局部去除DNA的特点,在RN

14、A抽提时获得DNA残留极少的RNA.不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用PC抽提的，否那么核酸必定降解.高藕沉淀蛋白质/静沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法.与PC抽提方法相比，除了纯度的稳定性可铺要低一点外，该方法几乎抑制了PC抽提的所有缺点.更快、更轻松去除蛋白旗所伴随的好处是，可以用于大规模抽提,缺乏是纯度（蛋白质残留）不够稳定。蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些.介旗纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高（虽然纯度不一定比PC纯化方法更高）.其致命弱点是样品过量.介旗可以分为

15、两大类，类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里：另外一类那么是颗粒状（如GgSSmiIk、磁性小珠等）.颗粒状的介质的纯化操作与经典的博沉淀差异不大，都是通过数次的加液-倒液过程，枯燥后，溶解即可获得纯化好的核酸.柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为参加的液体通过齿心后会进入另外个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力（不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留）.不过，介质纯化方法的本钱是最高的.5、静的沉淀醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质-主要是盆的别离。实际操作中，许多杂项也会与核酸起被界沉淀下来，尤其是当其它杂质

16、的浓度也比较高的时候。野的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及叫盐，当浓度到达一定水平后，都可能同步被沉淀下来。就核酸而言，标准的静沉淀要求有一定的盐及某一比例的解用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者腑的比例是不可更改的.实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度到达定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用酹也可以使核酸沉淀下来：或者含有耗，使用低比例的醉也可以使核酸沉淀下来（当然，得率可能会降低）-知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性：相反，当使用标准方法碰到何鹿-主要是纯度问SS-时，完全可以通过调整沉淀条件来改善.最有参考价值的是TR1Zo1提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留.另外一个问题就是，要整信核酸的髀沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程：调整器沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度.如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，源那么上不要使用低温沉淀。低温沉