布鲁氏菌的实验室检测方法.docx

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1、布鲁氏菌的实验室检测方法荧光偏振方法(F1uorescencepo1arisationassay,FPA)是以荧光素标记物作为示踪剂来检测抗原/抗体相互作用的一种简便技术，该方法属于同源性分析，分析物不需进行分离，因而该法简便快捷。FPA诊断布鲁氏菌的特异性和敏感性几乎和竞争E1ISA(Competitiveenzyme-Iinkedimmunosorbentassay,C-E11SA)相同，一次检测仅需15min,即可完成上百份样品的检测，可应用于动物群体布鲁氏菌病的检疫、筛查和净化。FPA检测方法在某些发达国家已经得到了大量应用，并经研制开发了商品化FPA检测试剂盒。而我国对FPA检测方法

2、的研究起步较晚，目前尚无商品化FPA检测试剂盒，进出口贸易中牛、羊布鲁氏菌病FPA检测方法均依赖于使用进口试剂盒，因此开发布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法有其现实意义。本研究使用异硫氟酸荧光素(F1uoresceinisothiocyanate,FITC)标记的布鲁氏菌光滑型1PS的小分子片段脂多糖-0-链(O-PO1ySaCCharide,OPS)作为抗原，通过对标记抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化，建立敏感性和特异性良好的布鲁氏菌荧光偏振方法，为多种动物布病检测提供快速高通量的新技术手段。材料与方法1材料1.1菌种：猪布鲁氏菌S2菌株(CVCC70502)由本实验室保存。1.2实

3、验用血清：布鲁氏菌病阳性血清国家标准品由本实验保存，布鲁氏菌病阴、阳性血清样本由本实验采集并保存。13主要试剂和仪器：布鲁氏菌荧光偏振试剂盒购自Diachemix公司；胰大豆肉汤(TSB)和胰大豆琼脂(TSA)购自美国BD公司；异硫氟酸荧光素(F1TC)、表面活性剂脱氧胆酸钠(Sodiumdeoxycho1ate)三乙胺购自Sigma公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪公司。低温离心机购自Sigma公司；超声破碎仪购自新芝生物科技有限公司；PowerpacUniversa1通用型电源购自美国Bio-Rad公司。目前，国内主要采取的布鲁氏菌病血清学检测方法有虎红平板凝集试验、试管凝集

4、试验及酶联免疫吸附试验，以及全血培养等方法。虎红平板凝集试验初筛，试管凝集试验定性的检测方法。当人感染布鲁氏菌后产生最多且持续时间最长的抗体是IgG,其次就是IgM抗体，虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测的主要是IgM抗体，较容易受到体内其它IgM抗体的干扰。虎红平板凝集试验特异性不高，受试验温度、凝集时间相对较短和人为主观因素的影响，不易准确判定结果，只能作为初筛，难免会有假阴性结果出现；而试管凝集试验是我国布鲁氏菌病的法定检测判定方法，但是该方法操作繁琐、费时，不适于大批量标本的检测，也受人为主观因素的影响。而采用E11SA法也是很好的方法，检出率高，但不容易判断患者的疾病发展阶段，即便患

5、者康复后IgG抗体也要在体内持续一段时间，因体内首先产生的IgM抗体，感染初期容易漏检，但此种方法检测的敏感性和特异性好，反应时间短，避免了人为因素的干扰，易标准化和质量控制，但也只能用于初筛；血培养方法，一般作为诊断方法，直接进行病原学诊断，检查阳性，可直接判定布鲁氏菌感染，此种方法与采血时机、采血部位、采血量以及患者菌血浓度的影响，容易造成假阴性结果。通过以上对实验数据的分析，对布鲁氏菌病实验室检测的四种方法各有优缺点，只有掌握其试验方法学知识，对不同方法实验室检测结果，结合临床做出正确诊断与鉴别诊断，不能被试验方法学的局限性所蒙蔽，合理判断疾病的发展阶段，给予合理解释，对布鲁氏菌病给予合

6、理治疗和用药，达到预期效果。布鲁氏菌(BrUCeIIa)是一种胞内寄生革兰氏阴性菌，能引起人和多种动物的急性和慢性感染，布鲁氏菌病(简称布病”)以流产和发热为特征，能够导致母畜流产、早产、不孕不育和产奶量下降，以及公畜睾丸炎和个体瘦弱等临床症状。更严重的是，人感染布鲁氏菌后往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。近年来，布病感染病例呈回升态势，早期快速检测是治疗和预防布病的关键环节。布病检测的常规方法包括细菌学和血清学方法。细菌学方法是布病流行、疫情判定及临床诊断中最直接的证据，但存在安全隐患且耗时长，在人群之间病例的检查及暴发调查等紧急情况下并不适用。自Weight在1897年建立了试管凝集反应后，血清学检测技术得到快速的发展和改进，包括各种凝集反应、沉淀反应、补体结合反应、试纸试验、标记抗体技术以及20世纪70年代发展起来的高灵敏度酶联免疫吸附试验。其中补体结合试验(Comp1ementfixationtest,CFT)是公认的确诊方法，但其实验条件复杂苛刻，结果判断也具有一定主观性，目前在国内很少被采用。试管凝集反应(Serumagg1utinationtest,SAT)敏感性较高，但单独使用时特异性较差，而且部分感染动物的抗体滴度达不到诊断水平，因而也易造成误诊和漏诊。高灵敏度、简便、快速的检测技术正在取代现有的常规测试。