流式细胞仪上机培训手册(共10).docx

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1、流式细胞仪上机操作（cMzuo）培训（PeiXh1I）手册k样本（yangben）理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1）取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2）编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a） 1号管：相应同型对照；b） 2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3）加样。用移液器取IOOUI细胞/管（约1x106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4）洗涤。加入ImIPBS/管，涡旋1600rpmmin,离心6min；5）染色。弃上清，加入100P1PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光

2、孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。）6）洗涤。加入Im1PBS/管，涡旋1600rpmmin,离心6min；7）重悬。弃上清，加入0.5m1PBS/管，混匀，上机检测（可选择BDFACSCantOn或BDAccuriC6）。（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4。C避光保存。）8）试验结果分析。（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。参考值：CD3+60.8-75.4%CD4+29445.8%CD8+18.2-32.8%NK(CD3-CD56+)9.5-23.5%二、上机检测(jiance)BDFACSCantoII简要(jianyao)操作流程启动(q

3、idong)流式细胞仪1打开流式细胞仪电源2启动计算机，打开软件登录3确保软件连接到流式细胞仪BDFACSDiva必要时，点击Cytometerconnect检查液体水平1启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。VdUjUTStdIu.vdix1gMrDusOc调OKCcirrniBDFACSDiVaBDFACSCanto2如果液流车未自动开启(kaiqi),选择CytometerF1uidicsStartupo3当液流启动(qidbng)完成后，点击OK关值皿的)对话框。检查气泡1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。图42流动室从1Wsstff

4、T*1asIpUJy*OvfJUn1.gI1&muFjEriiJijiU：?1A1ser11treH11kje1E.715GFam&rftcri71MEumtHjEeAUHiPh何1iRjrr.FjySineTI独口硕36Tn面51XC1,MI.ZhijIM世.1ni12如果没有看到气泡(qipio),进行第5步。如果看到气泡(qipao),点击CytometerC1eaningModesDe-gasF1owCe11.3当完成信息出现(ChUXian)后，点击OK。4如果还可以看到气泡，重复上述操作。注意：如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。5当您完

5、成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否己经完成。(MCoHnBdgriBDFACSCantoBDFACSDiva创建实验1按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。2创建文件夹：A在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的NewFo1deroB对该文件夹命名。3选择(xu*nz6)该文件夹，点击NewExperriment来创建(ChUangjian)八个新实验。4对该实验(Shiyin)进行重命名。5选择实验级别的细胞仪设置，然后点击InSPeCtOr(检测器)中的ParametersO数)选项卡。6按照(an

6、zhao)需要变更，添加或者删除参数。运行样本并记录OiE)数据1将样品管安装(anzhuang)到流式细胞仪中并点击AquireData(获取数据)。A把抽吸臂向左侧推。B把流式管放置到Srr上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。抽吸臂上有3个传感器引脚。试管底部应定位在这些引脚的中心位置内。CurrentActivtvActiVPI1Jhe1YVA1ThfPQhnioRatpctnpnn0GamEvent?F1appedT1mpOevt00:00:00DoscCortro1电NextTubeACQjireDoOReCCrdDotO叼

7、5HustiAcoisibonSetupStoppingGatrd1fvtvEontsIoRecord:IOOOOtvt、StxmCIntfi二1n电XorO0eGoto;*EeWTOWJPtoy;IIOOOCvt,FteWRate；Arajahnn9afcProcessedEvertsE1er1ron1:AbortRte:Irehod1ouV!ttectrocAtxrtcount：2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。3必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。4调节P1门仅围绕目的细胞群体。5调节好后，点击ReCOrdData（记录数据）以记录数据。6获取停止，取出试管。建

8、立全局工作表1如果用户参数中启用了Defau1tg1oba1worksheet（默认个局工作表）（默认选项），则全局工作表已经存在。展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。（注：如果DefaU1tgIObaIWOrkSheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的NeWGk）ba1Worksheet（新个局工作表）按钮创建个局工作表。）2使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。标记会出现（ChAX谊n）在点图轴上和所有的统计结果图中。A选择（xuanze）Experiment（实验（Shiyin）Experiment1ayout（实验布局）。B在1abe1S（标签）选项卡中，

9、为试管输入适当的标签。例如，在FrrC域中输入CD3。使用Tab键移动到下一个域。3在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。例如:创建PerCPCy5.5对SSC,FITC对APC,FITC对PE,FITC对PE-Cy7和FITC对APC-Cy7点图。设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域如：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC,SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。关机1选择(XUanZe)Cytometer(!ff1胞(Xibao)仪)FIUidiCSShUtdOWn(液流关闭(guanbi),并遵循所有的提示。2关

10、闭细胞仪电源。3退出BDFACSDiVa软件。C6简要操作流程开机1 .打开电脑，上样处放置一管双蒸水2 .打开C6仪器，其自动执行“startup，时间约5min,期间禁止开盖3 .当软件显示仪器状态为“CytometerConnectedandready”并亮绿灯时，则可以上样4 .(推荐用质控微球上机，F1I-H和F12-H直方图中必须有八个峰，F13-H必须有6-8个峰，即仪器分辨率CV值满足标准)米集样品1 .样品震荡混匀后置于上样二档处2 .设置流速，采样数目或时间或体积3 .点击(di*nji)“DotP1ot”或“Histogram”或“DensityP1of,选择(XUanZ

11、e)需要的图形4 .点击坐标轴参数，从下拉菜单中选择(XUanZe)需要的参数(如：叶口-A”FSC-A”)5 .点击“P1otSpec，选择“1inear”或者“1og”，设置坐标轴显示范围6 .右击坐标轴参数，选择“RenameParameters”，进行坐标轴重命名7 .选择“Disp1ay中的EventsDisp1aySettings”,选择显示的细胞数8 .选择样品位置，点击“run”，进行采样9 .取下样品10 .取新的流式细胞管置于上样针处，点击“backf1ush”，清洗上样针I1样品命名12 .点击“ZoomIn”，放大指定区域，设置阈值。点击“ZoomOut”，返回放大设门

12、1 .在图像下方点击设门工具，圈定指定区域，设置为门2 .点击相应图像上方的“Gate”，选择该图像需要应用的门设置补偿若样本是双荧光或三荧光检测，则实际图像显示中会用到荧光补偿1 .点击“SetCo1orCompensation72 .选择需要补偿的荧光参数，输入补偿值，点击“Save&C1ose”分析统计点击“Statistic”可选择预览选择的样品图形，所有的P1ot列表。所有的P1Ots,GateS以及统计学的列表，从中选择需要显示的信息关机清洗1 .放置一管去离子水，运行2min,清洗时VIOEVentS/sec才算干净2 .放置一管0.5%-1%有效氯的清洗液，运行2min3 .放

13、置一管去离子水，运行2min,运行结束后去离子水保留在上样处4 .退出软件，关闭电脑5 .关闭电源键(按住时间(Shijian)小于5秒钟)，仪器(yiqi)自动ShUtdOWrb时间(Shjian)约为13min,完成后仪器电源键自动关闭三、数据分析略。内容总结流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例取样(2)流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例取样(3)参考值:二、上机检测BDFACSCantoII简要操作流程启动流式细胞仪1打开流式细胞仪电源2启动计算机，打开软件登录3确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometerconnect检查液体水平1启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示(4)检查气泡1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡