猫细小病毒PCR检测方法.docx

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1、猫细小病毒PCR检测方法猫细小病毒Fe1inepan1eukopeniavirus,FP1V属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。1、试剂1.1要求除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。1.2试剂1.2.1核糖核酸酶（20mgm1）Q1.2.210%十二烷基磺酸钠溶液。1.2.310mgm1蛋白酶Ko1.2.4Tris-盐酸饱和酚（pH7.6）1.2.5酚-氟仿-异戊醇混合液（25：24：1）；在一灭菌棕色瓶中按25:24:1比例分别加入酚、氯仿、异戊醇。1.2.63mo11

2、乙酸钠（pH5.4）o1.2.7琼脂糖。1.2.810g/1溟化乙锭（ethidiumbromide,EB）:澳化乙锭20mg加灭菌双蒸水至20m1充分溶解混匀而成。1.2.950xTAE缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（TriS）242g、冰乙酸57.1m1、0.5mo11乙二锭四乙酸二钠溶液（p8.0）IOOm1,加灭菌双蒸水至IOOOm1充分混匀。1. 2.10加样缓冲液：聚蔗糖25g混酚蓝0.1g、二甲苯青O1g,加灭菌双蒸水至IOonI1充分溶解混匀而成。1.2. 112.5mmoIdNTPs（deoxyribonucIeosideriphosphates,脱氧核糖核昔三磷酸）。1.2.12

3、10*PCRBuffero12.13DNA分子量标准：D12000。1.2.14引物序列FP1V-F：S-Ccagctgaggttggttatagtg-3FP1V-R：5,-Ggtgcatttacatgaagtcttgg-S,。2、仪器设备2. 1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000*rpm以上。2. 2PCR扩增仪。2.3核酸电泳仪和水平电泳槽。2. 4微波炉。2. 5分析天平。3. 6恒温水浴锅。4. 7冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。5. 8微量移液器。6. 9凝胶成像系统（或紫外透射仪）。2. 10高压灭菌锅。2. 11超净工作台或生物安全柜。3、操作步骤3. 1样品的采集和处理4. 1

4、1采集动物粪便、拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理：(a)肛拭子、粪便(加适量PBS)等样品经4oC5000rpmmin离心2min,取上清液；(b)全血样品待血凝后经5000rpmmin离心2in,取血清；(C)取OIg肠道等样品与灭菌PBS(全称、浓度)按1:5的重量体积比制成悬液，匀浆后，反复冻融3次，在涡旋混合器上混匀后经4oC5000rpmmin离心IOmin,取上清液。3. 12制备的样品在2。C8保存时间应超过24h长期保存应分装成小管，置于-20。C以下，避免反复冻融。3. 2DNA的提取3.2. 1设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。

5、3. 2.2按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取。(a)取15m1灭菌离心管，加入处理样品511上清液4001和301(20mgm1)核糖核酸酶，混匀后，室温下作用20min;(b)加入43u110%的十二烷基磺酸钠溶液和51蛋白酶K,42。C水浴温育过夜(或55cC30in以上)；(C)加入等量的Tris-盐酸饱和酚，充分混匀，12000rpmmin离心5min,小心吸出上层水相于新的1.5m1灭菌离心管中；(d)加等量的酚-氯仿-异戊醇(25:24：1),充分混匀，12000rpmmin离心5min,小心吸出上层水相至新的1.5m1灭菌离心管中；(e)加1/10体积3mo11的乙酸钠(pH5.4),2.5倍体积预冷的无水乙醇15000rpmmin离心20min,弃去乙醇，75%的乙醇洗涤沉淀一次后真空干燥。用20u1灭菌双蒸水溶解沉淀，-20盖好电泳仪，插好电极，5Vcm电压电泳，30min45min(指示试剂跑至1/3处)3. 3结果观察用紫外凝胶成像仪或者紫外透射仪观察扩增结果。4、结果判定在阳性对照出现464bp的扩增带、阴性对照无目的条带的条件下，待检样品出现464bp的扩增条带，则判定为样品阳性，否则判定为阴性。