大鼠灌注取脑培训资料.docx

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1、大鼠灌注取脑大鼠灌注取脑用途：1 .用于常规HE染色，免疫组化分析。2 .冰冻切片可以不做脑组织固定。3 .不可用于westernb1ot和PCRo4 .如果观察脑组织的缺血、损伤或者其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。必要性：1 .脑组织较软，且细胞成份不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4%多聚甲醛灌注

2、固。2 .经前固定后，取a值操作时，可减少脑组织损伤。3 .脑内血液都在,HE染色后，可去除红细胞背景影响。大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：艇：1)麻醉2)开胸3K?脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或者切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定,切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水（4oC）Xm1,直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻（4。04%多聚甲醛Xm1,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。Tips:1 .多聚甲醛的配置：普通方法为：4%多聚甲醛PBS

3、缓冲液配法：称取40gPFA溶于装有500m1DEPC水的玻璃容器（烧杯或者烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065z使成乳白色悬液。用10mo11的NaOH值至7.4,使呈清澈状（滴加），再加入约500m1PBS,充分混匀（在冰浴或者冷水浴中），可再检测一下PH,过滤后定容至WOOmI,室温或者4保存备用。简便方法：先配好PBS,称好相应的多聚甲醛，37。C水浴或者温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55水浴小，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制酒己制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流2 .制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10

4、%水合氯醛按4m1100g的剂量腹腔注射麻醉动物。4 .沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5 .快速滴注生理盐水（室温）,同时剪开右心耳。约注入100-150m1f至流出液体血色较浅基本澄清，住手灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。6 .继续用4%多聚甲醛灌流250m1固定。7 .后固定：灌流后的脑组织置于4%PFA置4度冰箱内进行后固定，时间2h,过夜最好。补充：还有一种省

5、时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约IOOmI,见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100m1以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭彻底）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。的地：1 .多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。2 .暴露心脏这一步骤,容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉,用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，人工气胸后，月市萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。3 .经心脏灌注，有时穿刺针会误进右心室，月阱羊灌注主要

6、在肺循环起作用，体循环的血液影响不大。所以观察将穿刺针插入到主动脉内可以确保起到体循环灌注;中洗血液的效果，脑组织的血液冲干净后,才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是红细胞造成的背景染色。4 .灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。5 .关于生理盐水的温度的选择,有人认为因为是快速冲刷血管里的血液，低温造成血管收缩，灌注的效果反而没有室温的好。但是用低温的认为，低温有利于组织完整。6 .灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直,尾部竖起成向来线；所灌注的脑组织白而硬。7 .去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。常

7、见问题：1 .灌注取SSPF可用于Westernb1ot及PCR的原因。答：多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。Western中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一的线性肽链,从而能够用凝胶电泳进行份子量的梯度分离。多聚甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。此外，WB和免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体普通识蛋白的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。PCR要提RNA,RNA非常容易降解,必须新鲜取组织,然后尽快超低温冷藏或者即将抽提，否则非常容易降解。灌注固定的组织，原则上是能够提得出D

8、NA和RNA的，但是肯定会有较多的降解，普通不会这样做。2 .没有灌注固定的大鼠脑组织,能不能做切片和免疫组化？答：如果没有灌注固定，而是直接取材然后放入固定液中，可以进行免疫组化染色，只是效果不如灌注固定的好，特别是要做电镜时更明显。有的标记蛋白要求较高，固定不好就难以染好。3 .用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蜡切片，不知对免疫组化有无影响？答：固定时间过长蛋白多肽链都交连在一起了,抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果,抗原修复时普通的修复很难把抗原性恢复.可能会有影响，但不会太大。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。4 .灌注多长期？灌注液多少？看了不少经验，每一个人的灌注液用量都不一样，灌注速度也能没有很清晰的说法，灌注时间也不确定。我的总结为，还是看灌注成功的标志。现将看到的比较详细的处理方法列出。灌注速度，大家比较公认的是先快后慢。短期濯主：采用心脏穿刺快速灌注20min,其中生理盐水灌注50-100m1,4%多聚甲醛缓冲液灌注150m10长期灌注：灌注时间延长到1h,其中生理盐水灌注200m1,4%多聚甲醛缓冲液灌注400m1o短期灌注组脑组织结构保留基本良好,与长期灌注组相比稍差,研究皮层和海马结构损伤基本可以满足;长期灌注组结构保留最好,但是耗时长、固定液用量大,致使试验进度慢等缺点不容忽视。，对皮层和海马缺血再灌注损伤研究选择短期灌