谷氨酸脱氢酶GlutamatedehydrogenaseGDH试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、谷氨酸脱氢酶（G1UtamatedehydrOgeiase9GDH）试剂盒说明书微量法100管/96样注B:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：GDH（EC1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。渊定原理：GDHftHtNHd+-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD,引起34Onm吸光度下降。通过测定34Onm吸光度的下降速率，计算GDH活性。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酷标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸饱水。试剂组成和配制

2、：提取液：液体IoOm1XI瓶，4C保存；试剂一：液体20m11瓶，4C保存；试剂二:粉剂x2瓶，4C保存；粗胸液提取：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）：8000g4C离心Iomin,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：510的比例（建议称取约S1g组织，加入Im1提取液），进行冰浴匀浆。8000g4C离心Iomin,取上清，置冰上待

3、测。血清（浆）样品：直接检测。漏定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸饱水调零。2、样本测定（1）在试剂二中加入IOm1试剂一充分溶解混匀，置于37C（哺乳动物）或25C（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后12h内用完）；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入IOu1样本和1901试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,计算AA=A1-A2。GDH活性计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清(浆)中GDH活力的计算：单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗InmO1NADH定义为一个酶活力单位。G

4、DH(nmo1/min/m1)=AAV反总(d)x1()9v样T=643AA2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算：(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/min/mgprot)=AAV反总(d)xIO。H(V样XCPr)T=643AACpr(2)按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/min/g鲜重)=AAV反总(d)x104WxV样V样总)T=643AA+W(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为

5、一个酶活力单位。GDH(nmo1minIOice11)=AAV反总(d)x04(500xV样+V样总)T=1.286AAV反总：反应体系总体积，21041；:NADH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01m1：V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1：W：样本质量，g：500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、血清(浆)中GDH活力的计算：单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/min/m1)=AA*V

6、反总(d)x1()9v样T=1286AA2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算：(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/minZmgprot)=AAV反总(d)1Oo(VCpr)T=1286ACpr(2)按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/min/g鲜重)=AAV反总(d)x1()9(WxV样+V样总)T=1286AA+W(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GDH(nmo1/min104ce11)=AAV反总(d)x09+(500xV样+V样总)T=2.572xAAV反总:反应体系总体积,2IO41;:NADH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1：V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。