启航计划申请书.docx

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1、启航计划申请书一、申请人基本信息申请人姓名单位职位通信地址联系电话邮箱研究方向课题组负责人及成员情况代表成果二、参加启航计划拟研究的内容（字数不限）研究内容1）请详细说明您计划如何利用质谱流式技术助力自己的研究课题。2）请说明您参与本期启航”计划的研究内容及3例样本的情况。3）请描述您期望达到的结果。=样本情况样本类型 小鼠外周血裂红冻存样本 小鼠组织冻存单细胞（请具体写明组织来源） 小鼠新鲜单细胞（请具体写明来源）您预计的样本采集及寄样日期备注：1.投稿地址：请以启航-申请人-单位为邮件标题。（我们会在一周内回复收到确认邮件，如果一周内没收到确认邮件请联系我们）2.申请截止时间：2023年6

2、月25日。如对启航计划有任I可疑问和建议，欢迎联系我们咨询。联系方式：Emai1:电话：（同微信号）联系人：陈女士StandardBioTooIs中国（思百拓（上海）仪器科技有限公司，简称“思百拓）承诺对所有提交项目计划保密。启航计划最终解释权归思百拓所有。发送Emai1报名即视为同意StandardBiOTOOIS服务条款和隐私政策。ResearchUseOn1yandNotForUseinDiagnosticProcedures.附录一小鼠免疫分型试剂盒+扩展marker列表（黑色为小鼠免疫分型试剂盒中的markerf绿色为扩展的额外10个marker）序号AntibodyC1oneMas

3、s1CD453O-F1189Y2CD45R/B220RA3-6B2114Cd3CD4RM4-5116Cd4CD44IM7141Pr5CD3924DMS1142Nd6TCRH57-597143Nd7MHCC1assI28-14-8144Nd8CD69H1.2F3145Nd9CD43S11146Nd10CD36No.72-1147Nd11CD11bM1/70148Nd12CD196D5149Sm13CD271G.3A10150Nd14IgMRMM-I151Eu15CD49bDX5152Sm16CD66aCC1153Eu17CD152CT1A-4UC10-4B9154Sm18CX3CR1SAO11F

4、11155Gd19CD14Sa14-2156Gd20CD80B7-116-1OA1158Gd21CD279PD-1RMP1-3O159Tb22CD553-7.3160Gd23CD11cN418161Dy24CD366Tim-3RMT3-23162Dy25CD170Sig1ec-FS170071163Dy26CD274PD-11MIH5164Dy27CD127I1-7RaA7R34165Ho28CD621ME1-14166Er29CD335NKp4629A1.4167Er30CD138281-2168Er31CD217G6169Tm32NK1.1PK136170Er33GranzymeBGB11

5、171Yb34TCRG13172Yb35F480BM8173Yb36CD253C7174Yb37XCR1ZET1751u38CD197CCR74B12176Yb39CD8a53-6.7194Pt401y-6G1A8195Pt41CD3145-2C11196Pt421y-6CHK1.4198Pt43MHCC1assIIM5114.15.2209Bi附录二样本要求选择一：小鼠外周血裂红冻存样本,每个样本细胞数不低于5X106个细胞，细胞活率不低于80%选择二：小鼠组织解离的单细胞液氮冻存样本，每个样本细胞数不彳氐于5X106个细胞，细胞活率最好不低于80%。选择三(需解离后2h内运达)新鲜单细胞悬

6、液，每个样本细胞数不低于4x106个细胞，细胞活率不低于80%,需解离后2h内运达思百拓demoIabo附录三参考资料(推荐老师采用实验室经过验证的方案，以下的protoco1来源于文献，供各位老师参考)小鼠脾脏单细胞悬液制备材料剪刀镜子RPMI1640培养基(Corning,10-040-CV)ACK裂解缓冲液(镇-氯-钾)(ThermoFisherScientific,A1049201)FBS胎牛血清(Corning,35-010-CV)60mm细胞培养皿(Corning,430166)40m细胞筛(Corning,352340)50m1离心管(Corning,352070)3m1注射器(

7、Braun)实验步骤1 .通过二氧化碳吸入、颈椎脱臼或任何其他批准的方法使小鼠安乐死。2 .将动物背部放在解剖板上，用针或适当的大头针固定四肢，在腹部表面喷上70%乙醇。3 .向60mm细胞培养皿中加入RPM1并置于冰上。用剪刀和银子，取出脾脏置于培养皿中。4 .将40m细胞筛放在50m1离心管上。将脾脏切成10-12片，并放到细胞筛上。5 .从3m1注射器上取下柱塞，用橡胶端将组织磨过网孔。用足够的RPMI清洗网格，使细胞滴到管的底部。6 .将50m1离心管放入离机,4下300Xg离心7mino7 .弃上清，加入1m1ACK裂解缓冲液，轻轻摇动Imin裂解红细胞。8 .加入20m1含有10%

8、FBS的RPM1终止裂解反应。9 .将50m1离心管放入离心W1,4。C下300Xg离心7min。10 .弃上清，用3-4m1培养基(10%FBS的RPMI)重悬颗粒。I1待大团块沉淀，将顶部悬液(没有结块)转移到一个新的50m1离心管中。取出部分细胞进行计数。12.冻存。小鼠肺组织单细胞样本制备实睑准备A. RPMI-1640(Gibco)+1iberaseTM(Roche)+DNAseI(Roche)B. HBSS(1onza)+FBS(Gibco)+co11agenaseA(Roche)+DNaseI(Roche)实睑步骤1 .配制酶消化液A. RPMI-1640(Gibco)+20gm

9、11iberaseTM(Roche)+10U/m1DNAseI(Roche)B. HBSS(1onza)+5%v/vFBS(Gibco)+1mg.m11co11agenaseA(Roche)+0.05mg.m1_1DNaseI(Roche)2 .将样本组织倒入洁净的培养皿中，放置在冰板上，记录编号，拍照留存，加入4PBS,用PBS清洗两次3 .洗净的肺组织尽量沥干，放在培养皿盖子上并用洁净的无尘纸吸干组织上的液体，转移肺组织块至合适规格的尖底离心管中，用高压无菌的剪刀将样本组织尽量剪碎，呈糜状，加入适量消化液，涡旋混匀4 .用封口膜将离心管封好，将样本放置在37摇床(160-180rpm)消化

10、30-60min5 .消化结束后将悬液通过70m滤网转移至50m1离心管内，可采用研磨棒轻柔研磨并不断加入4oCPBS,直至滤网上的组织细胞随PBS滤过到离心管中，最后300g离心5min6 .弃去上层液体，3-5m1PBS重悬，再次过70m滤网转移至15m1离心管，补充4PBS至IOm1左右,清洗两次，30OXg离心5min7 .弃去上清,加入适量MaxparCe11StainingBuffer(SBI)重悬混匀，取201进行AO/PI计数及台盼蓝镜检，检验细胞活率并调节细胞浓度。细胞冻存材料Na1geneMr.Frosty梯度降温盒(TherTnOFisherScientific,5100

11、-0001)细胞冻存管(ThermOFisherScientific,377267)DMSO(Sigma-A1drich,D2650)实睑步骤1将梯度降温盒从4。C移至室温，确保里面有足够的异丙醇。2 .标记细胞冻存管，注明样本名称，细胞总数和冻存日期。3 .取1-5X1O7细胞悬液，离心后弃上清,用0.5m1100%FBS重悬细胞，然后滴入0.5m1含20%DMSO的FBS,轻轻搅拌离心管。4 .将Im1细胞悬液移入冻存管，放到梯度降温盒中，在-80。C冰箱放置12h-14d后，将冻存管放入液氮罐中冻存。参考文献1. Wa1ter,FruzsinaR.,eta1.ANove1InVitroM

12、ouseMode1toStudyMycobacteriumtubercu1osisDisseminationAcrossBrainVesse1s:ACombinationGranu1omaandB1ood-BrainBarrierMouseMode1.Currentprotoco1sinimmuno1ogy130.1(2023):e11.2. BarbonzChristineM.zeta1.A11oanergizationmethodforinducinga11ospecifichyporesponsivenessinPBMCexposedtoa11ostimu1ationinvitroint

13、hecontextofcostimu1atorymo1ecu1eb1ockade.Immuno1ogica1To1erance:MethodsandProtoco1s(2019):103-118.3. ZhouzYangzeta1.Methodsforstudyingmouseandhumaninvariantnatura1ki11erTce11s.InvariantNatura1Ki11erT-Ce11s:MethodsandProtoco1s(2023):35-57.4. OrecchionizMarcozeta1.F1owCytometryandMassCytometryMasscyto

14、metryforMeasuringtheImmuneCe11Immunece11sInfi1trateinAtherosc1eroticArteries,Atherosc1erosis:MethodsandProtoco1s.NewYork,NY:SpringerUS,2023.779-800.5. HanidziarzD.zeta1.Characterizationofpu1monaryimmuneresponsestohyperoxiabyhigh-dimensiona1masscytometryana1yses.ScientificReports10.1(2023):4677.6. SchynszJoey,eta1.Non-c1assica1tissuemonocytesandtwofunctiona11ydistinctpopu1ationsofinterstitia1macrophagespopu1atethemouse1ung.Naturecommunications10.1(2019):3964