核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识2023要点.docx

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1、核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识(2023)要点摘要核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA1DI-TOfMS)技术在结核病与非结核分枝杆菌病病原学和耐药性诊断中的应用越来越多，为早期诊断、鉴别诊断和耐药鉴定提供了快速、准确的依据。然而，在实际应用中，临床医生对标本的选择、留取、送检时机及注意事项、报告结果的解读等的理解和掌握参差不齐，尚需规范化。本共识总结了核酸MA1DI-TOfMS检测技术应用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断的临床适应证和标本采集注意事项,介绍了如何正确解读核酸MA1DI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种和耐药性的报告

2、结果，以进一步规范核酸MA1DI-TOfMS技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用,提高临床诊断水平，指导临床开展早期精准有效的治疗。结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。世界卫生组织(WHO)估计，2023年全球有1060万例新发结核病患者，死亡近160万例，新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者。其中，我国新发78万例结核病患者,新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例，是全球结核病及耐药结核病高负担国家之一；肺外结核占所有结核病的15%40%,因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点；全球由非结核分枝杆菌(NTM)引起的疾病比例呈

3、现上升趋势,在很多发达国家，NTM病甚至超过了结核病。我国的NTM分离率也逐年增高，南方和沿海地区高于北方和内陆地区。宿主及环境因素对NTM病的流行也有很大影响。临床上以NTM肺病最为常见，NTM肺病的临床表现、放射影像学特征和痰涂片抗酸杆菌染色检查特征与肺结核极其相似，且大多数NTM对常用抗结核药物呈天然耐药或耐药率高，需要经过数月至数年的漫长复杂的治疗，有时因不能耐受药物的不良反应,导致治疗不完全或再感染而复发，对人类健康构成重大威胁，已成为全球关注的公共卫生健康问题。因此，准确快速诊断和鉴别诊断结核病与NTM病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。第一部分核酸基质辅助激光解

4、吸电离飞行时间质谱技术的基本原理与特点基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA1DI-TOfMS)技术是一种直接分析大分子的质谱技术。核酸MA1DI-TOfMS技术是以核酸作为细菌鉴定的生物标志物，基本原理是通过对多靶点基因片段进行多重PCR特异性扩增去除脱氧核糖核甘酸后，进行各个位点的单碱基延伸反应，经处理后的延伸反应产物同质谱所需基质混合，放入飞行时间质谱仪中运行，每份样本会得到独特的指纹质谱图，经过判读后获得菌种及耐药信息。核酸MA1Di-TOFMS技术可以同时针对分枝杆菌的保守基因片段，例如16SrRNA.hsp65等基因的多态性进行设计从而快速鉴定分枝杆菌菌种。已有研究证实，核酸MA1

5、DI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌及其耐药性具有较高的准确性。核酸MA1DI-TOfMS技术检测分枝杆菌及其耐药性具有较好的诊断价值和临床应用前景。第二部分共识制定的过程第三部分核酸MA1D1-TOFMS技术鉴定分枝杆菌菌种及其耐药性一、应用核酸MA1DI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种目前，核酸MA1DI-TOfMS技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个NTM菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种（表2）,几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌，可以满足临床实现快速鉴定分枝杆菌菌种的要求，为临床医务人员提供诊断参考。二、应用核酸MA1DI-ToFMS技术检测分枝杆菌对常用药物的耐

6、药性目前核酸MA1DI-TOfMS技术可检测结核分枝杆菌4种一线抗结核药物（异烟的、利福平、叱嗪酰胺和乙胺丁醇）和常用的二线抗结核药物（氟嗟诺酮类、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、环丝氨酸、氯法齐明、贝达嘎琳、利奈嗖胺）的耐药基因型；并可检测NTM大环内酯类和氨基糖昔类药物的耐药基因型，了解其耐药性（表3,4三、应用核酸MA1DI-TOfMS技术检测分枝杆菌耐药基因位点同义突变基因突变一般包括错义突变、同义突变和无义突变3种类型，核酸MA1DI-TOfMS技术除可检测上述的错义突变外，目前还可检测到的结核分枝杆菌常见同义突变如表5所示。第四部分应用

7、核酸MA1DI-TOfMS技术检测分枝杆菌病的临床适应证和送检时机对可疑肺结核、肺外结核和NTM病患者的快速诊断和鉴别诊断，以及确诊结核病、NTM病但治疗效果不理想患者的药敏检测，应尽早送核酸MA1DI-TOfMS检测。见图1。推荐意见1:近期具有明确的肺结核密切接触史，咳嗽、咳痰超过2周，伴或不伴有咯血、胸痛、胸闷、气短等呼吸道症状和低热、盗汗、乏力、体质量减轻等全身中毒症状，临床常用结核病病原学检查结果为阴性，影像学检查存在肺部病变，需快速确诊的患者，建议送痰和支气管肺泡灌洗液进行培养的同时送核酸MA1DI-TOfMS检测，可在12d内快速鉴定病原菌以明确诊断。推荐意见2:胸部影像学表现高

8、度怀疑肺结核，Y-干扰素释放试验（IGRA）阳性,结核菌素皮肤试验（TST）强阳性或重组结核杆菌融合蛋白（EC;宜卡）阳性，临床常用病原学检测阴性,诊断性抗结核治疗效果差，适合送MA1DI-TOfMS检测，可快速明确诊断。推荐意见3:疑似结核性胸膜炎患者，胸腔积液常规结核分枝杆菌细菌学检查阳性率低，建议按要求送胸腔积液进行核酸MA1DI-TOfMS检测以提高病原学检出率。推荐意见4:疑似肺外结核，如结核性脑膜炎、结核性淋巴结炎、骨关节结核、肠结核、结核性腹膜炎、泌尿生殖系统结核、结核性心包炎、皮肤结核等肺外结核患者，治疗效果差，分泌物和（或）活检、手术组织临床常用病原学检测阴性时，适合送核酸M

9、A1DI-TOfMS检测。推荐意见5:胸部影像学表现高度疑似NTM肺病，尤其是IGRA阴性和EC皮肤试验阴性，TST阳性者，适合及早送痰和（或）支气管肺泡灌洗液进行核酸MA1DI-TOfMS检测。推荐意见6:慢，的市部疾病，包括肺囊性纤维化、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、尘肺、肺间质纤维化、支气管哮喘、过敏性肺炎、变应性支气管肺曲霉菌病等患者，经规范性治疗效果差，尤其合并免疫功能受损,如艾滋病病毒（HIV）感染/艾滋病（AIDS）和器官移植等长期服用免疫抑制剂的患者，高度怀疑并发肺结核或NTM肺病时，适合送核酸MA1DI-TOfMS,以快速鉴定病原菌及其耐药性。推荐意见7：对穷或手术，包括医疗

10、美容手术后出现局部皮肤反复感染伤口经久不愈的患者,建议送伤口分泌物进行核酸MA1DI-TOfMS,排除NTM感染。推荐意见8:确诊NTM病，包括NTM肺病和肺外NTM病的患者，需要明确感染菌种对药物的敏感性,可进行核酸MA1DI-TOfMS检测。推荐意见9:复治肺结核和肺外结核，抗结核药物治疗效果不佳或者病情复发，高度怀疑耐药的患者，进行痰、分泌物、活检及手术组织表型和基因型药敏试验的同时，可送核酸MA1DI-TOfMS进行耐药性检测；高度怀疑异质性耐药者,可在治疗过程中进行核酸MA1DI-TOfMS耐药性检测跟踪。推荐意见10:肺结核和肺外结核诊断明确，痰、分泌物和（或）活检、手术组织Gen

11、eXpertMTB/RIF检测利福平耐药的患者，建议送核酸MA1DI-TOfMS检测结核分枝杆菌对其他一线和二线抗结核药物的耐药性。推荐意见11:对于鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等致病性NTM,建议送核酸MA1Di-TOFMS进行耐药性检测；对于弱致病性的NTM,可根据送检样本来源、临床症状和影像学表现，决定是否进行核酸MA1DI-TOfMS检测其耐药性。第五部分标本的采集、运输、检测及实验室质量控制、出具报告一、生物标本的采集(-)生物标本采集过程的注意事项推荐意见12:生物标本采集必须由专业人员执行，采取适当的感染控制措施；收集标本的专用容器上应注明患者及标本的详细信息；对高度怀

12、疑分枝杆菌病者，建议采集2份以上同类型或不同类型的样本；采集后的样本应该立即送检，否则须放在4冰箱暂存且在24h内进行灭活处理。(二)不同类型临床生物标本采集时的注意事项推荐意见13:不同类型的临床生物标本采集量不同。采集液体类标本应静置，取下层沉淀物至采样管中，装入密封袋中送检；对于固体标本和组织类标本，最好采集新鲜病灶处样本立即送检，必要时可采集石蜡包埋的组织标本进行进一步检测。二、生物标本的运输和保存推荐意见14:标本的运输和保存需遵循生物安全管理规定，符合安全要求。妥善保存未用完的核酸样本或者临床标本，建议根据生物样本管理方法命名并保存样本，以便于未来追溯。三、样本的核酸MA1DI-T

13、OfMS检测四、质量控制推荐意见15:样本前处理、核酸提取、PCR反应和质谱分析，每一步都需要进行质量检验，PCR反应和质谱分析需要设置阴性对照和阳性对照。要定期进行室内质量控制和室间质量控制。五、出具报告推荐意见16:病原检测报告信息必须完整准确，尤其要对患者信息、检测标本、检测参数进行严格审核才能出具报告；在出具耐药检测结果时,应指出相应耐药水平程度，以更好地指导临床医生用药。第六部分临床结果判读一、结核病的诊断推荐意见17:对于呼吸道样本,核酸MA1DI-TOfMS检测结果为结核分枝杆菌阳性者，可进一步参考WS288-2017肺结核诊断做出综合判断。对于经核酸MA1DI-TOfMS检测为

14、阴性而临床高度怀疑结核病者，可根据患者意愿，再次送样本进行核酸MA1DI-TOfMS检测，以提高检出率。推荐意见18:对于非呼吸道标本，如脑脊液、胸腔积液、心包积液等各种体液样本，核酸MA1DI-TOfMS检测结果为结核分枝杆菌阳性，则具有较好的临床诊断价值，优先考虑肺外结核的可能。推荐意见19:对于鉴定为结核分枝杆菌复合群感染的患者，进一步进行一线和二线抗结核药物的耐药性检测，可实现快速诊断的目的，尽早提供精准的个体化治疗方案，有利于控制结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌的进一步传播。二、NTM病的诊断推荐意见20:针对痰液样本，建议送检2次分开采集的样本，结果为同一种NTM菌种才能做出诊断

15、。推荐意见21:针对支气管肺泡灌洗液样本，结果为阳性即可做出诊断。不同临床样本所得到的结果，其临床意义有所不同，来自血液、淋巴结、骨髓、肝脏、肾脏等非开放无菌来源的样本检出NTM往往意味着致病菌,而呼吸道、尿液样本检出的NTM,需要排除污染或定植菌的可能。三、耐药性诊断(-)对常用抗结核药物耐药基因检测结果的判读推荐意见22:对于确定的结核分枝杆菌感染者，建议送核酸MA1DI-TOfMS检测上述几种常见药物的耐药性，以提供快速而全面的预测判断，尽早给予个体化精准治疗。其中，一线抗结核药物利福平和异烟脱的耐药基因突变检测可很好地预测耐药性。其他大部分药物也可检出绝大部分临床常见耐药突变类型，可以

16、较好地预测耐药性。推荐意见23:对于强烈怀疑对毗嗪酰胺耐药的菌株，不推荐送核酸MA1DI-TOfMS检测，必要时可以对整个PnCA基因进行测序分析。推荐意见24:对于怀疑对氟瞳诺酮类药物耐药的菌株，可以送核酸MA1DI-TOfMS检测,若检出耐药基因突变，很可能该菌株对氟喋诺酮类药物耐药；如果未检测到突变，也不能排除耐药的可能性。（二）对于部分抗NTM药物的耐药基因与耐药位点结果判读推荐意见25:对于检测出鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌各亚种、堪萨斯分枝杆菌、蟾蛛分枝杆菌等跟临床疾病密切相关的NTM,建议送核酸MA1DI-TOfMS检测大环内酯类和氨基糖苗类药物的耐药性。推荐意见26:对于检测出弱致病性的与临床疾病不相关的NTM,可根据临床症状和影像学表现决定是否送核酸MA1DI-TOfMS检测其耐药性。