肉毒碱棕榈酰转移酶CPT1试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、肉毒碱棕稠酰转移酶（CPT-I）试剂盒说明书微法IOO管用6样注意:正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：肉毒碱棕桐酰转移醉是存在于线粒体内膜的一类酰基转移随。可逆地催化从酰基辅函A将酰基转移至1-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。涌定原理：基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶（CPT”的作用，产生脂酰肉碱，并释放出琉基辅酶A（CoA-SH）,与EHman试剂DN-TB反应后，产生黄色的TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm）,来定量分析CPT-I的活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水

2、浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸储水试剂组成和配制：试剂一：液体IOOm1X1瓶，-20C保存：试剂二：液体20m11瓶，-20保存；试剂三：液体1.5m11支，-20保存；试剂四：液体30m11瓶，49保存；试剂五：粉剂X1瓶，4C保存；试剂六：粉剂X1支，-2（C保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOu1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆液于600g,4C离心5min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，I1OOOg,4离心Iomin。上清液即胞浆提取物，可用于测定

3、从线粒体泄漏的CPT-I（此步可选做）。在步骤的沉淀中加入200U1试剂二和2u1试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W,超声3秒，间隔10秒，重夏30次），用于线粒体CPT-I测定。浦定步骤：1、分光光度计或酹标仪预热30min以上，调节波长至412nm,蒸储水调零。2、样本测定（1）在试剂五中加入Im1无水乙醉，混匀，再加入22m1试剂四，混匀，37*C（哺乳动物）或25C（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融；（2）在试剂六中加入Im1蒸谣水，混匀，37C（哺乳动物）或25C（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融：(3

4、)在微量石英比色皿或96孔板中加入10U1样本、220U1试剂五和IoH1试剂六，混匀，记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2,计算A=A2-A1,CPT-1活性计算：a.使用微石英比色皿潴定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1/min/mgprot)=AAxV反总(d)109(VfCpr)T=880ACpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计毙：单位的定义：锤g组织每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1ming鲜重

5、)=AV反总(d)109(WXV样+V样总)T=177.8AW(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1min104ce11)=AAxV反总(d)109(50OXV样V样总)T=0.3556AV反总：反应体系总体积，2.41041；：TNB摩尔消光系数，1.36K)4mocm;d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b.使用96孔板测定的计

6、算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1/min/mgprot)=AAxV反总(d)109(VfCpr)T=1760ACpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1/min/g鲜重)=AV反总*(d)109(WXV样V样总)T=355.6AW(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmo1TNB定义为一个酶活力单位。CPT-I(nmo1min104ce11)=AAV反总(d)109(50OXV样W样总)T=0.711AV反总:反应体系总体积，2.41041；:TNB摩尔消光系数，1.361041/mo1/cm；d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g：500：细胞或细菌总数，500万。