艾塞那肽的固相合成与纯化研究 优秀专业论文.docx

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1、艾塞那肽的固相合成与纯化研究中文摘要本文采用了 Fmoc固相肽合成法合成艾塞那肽异构肽，并且用反相HPLC纯化该肽。通过选择适合合成条件和纯化条件最终合成出具有高纯度的艾塞那肽异构肽，这样的肽适合于下一步的活性研究。在艾塞那肽异构肽的Fmoc固相肽合成策略中，我们采用氨基酸过量法。在连接前18肽的时候，每次加入的氨基酸采取4倍过量；而后面加入的18个氨基酸采取5倍过量。这种过量的方法有利于提高实验产率。在用反相HPLC纯化异构肽时，我们试验了不同的洗脱梯度对该肽洗脱峰的影响。结果发现35-38%的洗脱梯度可以明显看到被单独分开的主峰。收集该峰后得到的样品再用反相HPLC进行检测，纯度达90%以

2、上。纯化后HPLC图有明显被独立分开的又尖又高的主峰，而且主峰在两侧少见杂峰。这样说明纯化得到样品纯度较好。关健词艾塞那肽；固相合成；纯化中文摘要1关健词11前言4Li n糖尿病概述41.2 II型糖尿病药物研究进展41.2.1 Katp通道为靶点的药物51.2.2 二肽基肽酶IV为靶点的抑制剂51.2.3 氧化物酶增殖体激活受体为靶点的药物61.2.4 GLP-1受体为靶点的糖尿病治疗61.3 GLP-1及其类似物艾塞那肽713.1 胰高血糖素样肽-1713.2 2艾塞那肽82材料与方法92.1 材料与试剂92.1.1 多肽合成所用试剂与材料92.1.2 主要仪器102.2 实验方法102.

3、2.1 树脂的溶胀112.2.2 脱保护反应112.2.3 连接反应112.2.4 切割|112.2.5 纯化112.2.6 质谱鉴定123.1 艾塞那肽异构肽粗品过反向HPLC柱123.2 质谱检测143.3 产率计算15参考文献16致谢错误!未定义书签。1前言i.i n糖尿病概述糖尿病(DM, Diabetes Mellitus)是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。由人体内胰岛素绝对或相对缺乏所致，以高血糖为主要特征，伴随因胰岛素分泌及作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。目前，糖尿病在世界范围内已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。无论是发达国家还

4、是发展中国家，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率都在逐年增加。毫无疑问，糖尿病已经变成在世界范围内爆发流行的疾病，而且有扩大化和年轻化的倾向。由于糖尿病本身及其合并症对人们的身心健康危害越来越大，因此，我们有必要让更多的人了解它，寻找更好的药物和治疗方法来攻克这一世界难题。1999年，WHO咨询委员会与国际糖尿病联盟制定的新标准将糖尿病分为四种临床类型，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病。目前，糖尿病患者中有95%属于H型糖尿病。随着日常生活水平的不断提高以及我国老龄化人口日益增多，II型糖尿病的发病率在我国不断上升，糖尿病患者数量已居世界第二。1.2 n型糖尿病药

5、物研究进展n型糖尿病药物主要是通过促进胰岛e细胞分泌胰岛素或改善靶组织对胰岛的敏感性进行治疗;目前，已有多种类型的抗n型糖尿病的药物在临床上应用，主要包括促胰岛素分泌剂、仁葡萄糖甘抑制剂、胰岛素增敏剂和胰岛素等。尽管传统抗糖尿病药物已经在临床上广泛应用并具有良好疗效，但仍存在着未能解决的诸多问题，其中最为显著的两个问题就是药物在降低高血糖方面不能维持长期疗效和不能有效缓解病情达到疗效指标，此外安全性和副作用同样是这些抗糖尿病药物亟待改善的两个严峻问题。因此人们正在试图改用其他不同类别药物进行治疗。随着分子生物学研究的深入，关于II型糖尿病发病中一些关键机制也取得了一些进展，如葡萄糖依赖的胰岛素

6、分泌功能受损、以及与胰岛素分泌有关的离子通道等方面的研究。细胞和分子水平上进行药物作用靶点的研究也已取得了引人瞩目的进展，发现了大量与糖尿病发病机制有关的新的受体和酶，这些靶点的发现为药物筛选提供了指导作用。1.2.1 Katp通道为靶点的药物胰腺分细胞是一种电兴奋性内分泌细胞,ATP敏感性钾通道(Katp)的活性改变对胰岛素的分泌均具有重要的调节作用。目前普遍认为，Katp通道的初级调节子是ATP/ADP比值，其中ATP抑制通道活性而ADP增强通道活性。因此，Katp通道作为一类药物作用靶点，为H型糖尿病治疗的新药发现提供了一种思路。人们在以Katp通道为靶点研究胰岛素释放的过程中，发现了多

7、类抑制剂或激动剂。瑞典科学家就在对啮齿类动物的研究中发现了一种长链辅酶A(LC-CoA)酯，是新一类强效Katp通道活化剂，从而可能为未来H型糖尿病的治疗提供新思路，。1.2.2 二肽基肽酶IV为靶点的抑制剂近年来，人们发现许多醵在调节血糖平衡中起着重要的作用。因此，以各种酶为靶点来筛选具有抗糖尿病活性的药物发展迅速。二肽基肽酶(DPPIV)抑制剂就是针对DPPIV酶作为作用靶点开发的一类口服型糖尿病新药。DPPW酶分布广泛，是一个同源二聚体的跨膜丝氨酸蛋白酶，能水解体内胰高血糖素样肽-l(GLP-l)等多种激素而DPPW酶抑制剂能够抑制DPPIV酶的生物活性从而提高GLP-1的活性，从而刺激

8、胰岛素的释放。近年来，诺华、默克和百时美施贵宝公司等多家制药公司都在竞相开发口服型DPPIV酶抑制剂。美国默克公司研发的sitaglitpin已于III期临床阶段。DPPN醵抑制剂最主要的特点是维持糖基化血红蛋白(HbAlc)的减少，并且是口服给药，已有数据显示DPPIV酶抑制剂长期治疗的耐受性良好，没有出现与之相关的增重病例。于2006年10月上市；诺华和百时美施贵宝公司研发的vildagliptin (LAF237)和saxagliptin (BMS-477118) 正处1.2.3 过氧化物酶增殖体激活受体为靶点的药物目前，上市药物中50%以上是以受体为作用靶点的，其中一部分则是细胞内的核

9、受体为靶点。过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)y就是一个与多种基因调节有关的核受体。研究表明，它能激活与脂肪细胞分化有关的基因，是胰岛素增敏剂暖陛烷二酮(TZD)类药物的功能性受体。近年来PPARy已成为重要的糖尿病药物作用靶点。T2384就是最新研究合成的一个PPARy配体，它能够在不增加体重的前提下改善对胰岛素的敏感性，可以和降糖药物罗格列酮联合用药以抑制罗格列酮所带来的副作用胃。1.2.4 GLP-1受体为靶点的糖尿病治疗胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)。当机体摄入营养物质时，肠内分泌细胞释放

10、GLP-1,通过与GLP-1R高度特异性结合使其活化，增加了糖刺激的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的产生，通过抑制胃的排空和增加饱食感调节营养摄入，并且抑制胰高血糖素的释放。使餐后血糖降低并维持在恒定水平。在生理条件下，GLP-1刺激胰岛素分泌的作用依赖于血糖浓度，不会因持续分泌而发生低血糖。短期内使用GLP-1治疗H型糖尿病的价值和安全性已得到证实。由于GLPJ在体内很快被DPPIV酶降解,其半衰期较短，因此开发GLP-1药物的缓释设计以及GLP-1类似物设计研究成为H型糖尿病研究的新方向。目前,从希拉毒蜥的唾液中提取的一种伸展蛋白艾塞那肽其结构与人体内的GLP-1相似，具有与GLP-1同样的生

11、物活性并能够达到降糖效果，而且艾塞那肽的半衰期较长，降糖作用通常能达45个小时，同时还有减肥的功效，因此被开发成为新一代降糖药1.3 GLP-1及其类似物艾塞那肽1.3.1 胰高血糖素样肽1胰高血糖素样肽(GLP-1)是一种主要由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素。肠腔内的营养物质如葡萄糖、脂肪等能直接刺激GLPJ的释放GLP-1是胰高血糖素原(PG)基因翻译加工后的产物，哺乳动物中GLP-1有多种分子形式，包括GLPJ (1-37)、GLP-1 (7-37)和GLP-1 (7-36)。其中GLP-1 (7-36)是人体内天然存在的，含有30个氨基酸，是促胰岛素分泌作用中最强的GLP-

12、1肽。GLPJ还可以促进胰岛e细胞增殖，调控胰岛e细胞特异性基因的表达，降低食欲减缓胃排空等生理功能。GLP-1可被DPPIV酶迅速降解，半衰期仅数分钟，降解生成的GLP.1(9.36)是体内GLP-1R天然的拮抗剂由于GLPJ在人体内半衰期短，因此作为H型糖尿病药物其生物学效应受到很大限制。研究发现天然艾塞那肽具有与GLP-1几乎相同的生物学活性，不会被DPPIV酶分解，故血浆半衰期更长，具有良好的临床应用前景,是一种长效的GLP/R激动剂I，。1.3.2 艾塞那肽近年来研究发现，许多非哺乳动物体内的多肽也能够在哺乳动物体内发挥生物效应，艾塞那肽就是其中之一。艾塞那肽是由美洲西南部的一种希拉

13、毒蜥(Helodenna Suspectum)唾液腺分泌的由39个氨基酸组成的多肽，分子式为Cl84H282N5o06oS,分子量是4187.61。这种毒蜥一年只吃“四餐”，其消化系统长期处于休眠状态，艾塞那肽能激活处于休眠状态的消化系统，刺激胰腺分泌胰岛素，使食物得到消化吸收。它还能抑制使血糖升高的胰高糖素的释放，从而达到降糖效果。1992年第一次分离提取出来艾塞那肽卜1998年第一次将艾塞那肽基因从毒蜥的唾液腺中克隆出来。研究表明在哺乳动物体内没有艾塞那肽的表达。起初对艾塞那肽进行一系列的研究是因为它能够刺激胰脏的腺泡细胞分泌淀粉酶，但随后的实验发现它能够作为哺乳动物中GLP-1R的激活剂

14、H发挥与GLP-1几乎相同的生物活性。而且艾塞那肽与哺乳动物体内的胰高血糖素家族有着很高的同源性，与人的胰高血糖素(glucagon)有48%的同源性，与GLP-1有53%的同源性，N端的同源性高达80%,如图1.2.1。尽管艾塞那肽与GLPJ有很高的同源性，但对蜥蜴体内艾塞那肽的前体基因和基因GLPJ的前体基因(proglucagon)关系进行研究发现，它们分别是由不同的前体基因剪切而来的：GLP-1的前体基因只在胰腺和肠内发现，在唾液腺中并未发现；艾塞那肽只在唾液腺中有表达卜|。另外还有一种天然存在的艾塞那肽剪切类似物exendin(9-39),同艾塞那肽一样能与GLP-1R特异性的结合，

15、但不能激活受体，是GLP/R的天然拮抗剂艾塞那肽与GLPJ受体具有高度亲和性，能通过刺激GLP-1受体诱导腺甘酸环化酶(cAMP)的生成，产生与GLP-1几乎相同的生物效应人工合成艾塞那肽(Exenatide)注射给药后，能够调控机体胰岛素在体内发挥作用，从而达到控制血糖的效果|。2材料与方法2.1 材料与试剂2.1.1 多肽合成所用试剂与材料树脂(Rink Resin)； Fmoc氨基酸衍生物；苯骈三氮哩-氧-三(二甲基氨基)磷.六氟磷酸盐(BOP)； 1 .羟基苯骈三氮唾(HOBt),购于吉尔生化(上海)有限公司；乙二硫醇(EDT) ； N-甲基吗咻(NMM)；茴香乙酸，购于SIGMA公司；三氟乙酸(TFA)购自Fluka公司；乙懵(色谱纯)；N, N二甲基甲酰胺(DMF)；哌咤；甲醇均为分析纯。多肽合成主要试剂配制脱保护试剂：20% (V/V)哌咤/DMF溶液。切割溶液：TFA：苯甲醛：EDT=38： 1： 1 (V/V/V)。肽沉淀溶液：乙醛。游离氨基检测试剂溶液A： 5 g水合玮三酮溶于100 mL乙醇中，稍加热或搅拌促溶。溶液B： 8 g熔融苯酚溶解