疫苗生产用冻干保护剂的分类和作用机理研究.docx

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1、冻干保护剂是除赋形剂外,给于药物有效成分在冻干机冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。常用保护剂有糖类、白蛋白、聚乙二醇等等。冻干保护剂可影响生物制品的质量、效价和稳定性，改变生物制品的生产工艺，提高产品干燥能力并增大产品批次间的稳定性。耐热冻干保护剂有免疫活性但无药理活性,可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性,初次干燥时在适宜的温度下疫苗不倒塌，企业低成本即可获取。一、分类（一）按相对分子量分按相对分子量分可分为低分子化合物和高分子化合物。“酚子化合物彳氐分子化合物可提高微生物存活率,形成均一悬液,起到水分缓解作用。如：酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；中性物质：葡萄糖、孚廉、蔗糖、海

2、藻糖、山梨醇；碱性物质：精氨酸、组氨酸。2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、明胶、蛋白陈、脱月血粉。水解明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为-12oCo对微生物的保护作用高出普通明胶10%以上。脱脂奶粉可促进升华、加热灭菌，易取得均质产品，并扩大细胞相互间的距离。（二）按功能和性质分1耐热冻干保护剂耐热冻干保护剂在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，如海藻糖、蔗糖、聚维酮（PVP）等。2.填充剂可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，如：甘露醵、明胶等。3.

3、抗氧化剂产品的自身氧化可消耗冻干样品内部和环境中的氧；放入电子或氢离子，可阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。如硫代硫酸钠、维生素E、维生素C等。4.酸碱调整剂在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品PH值调整到活性物质ZUi稳定区域。常用的有：磷酸二氢钾、磷酸氢钠。（三）按物质的种类分1糖/多元醇类单糖（葡萄糖、半乳糖）：糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，起保护作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低温保护功能?脱水保护作用；海藻糖则具有相对较高的玻璃化转变温度。海藻糖一蛋白质一水微冰晶的形成，有效防止了水对玻璃化态的增塑作

4、用。并且其内部氢键较少，有利于蛋白质分子间形成氢键。多元醇（甘露醵、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一样的作用。甘露醇无菌滤液稳定，不易被氧化，可提供支持结构，并且不与活性组分发生反应；山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醵大，在常温下呈粘稠的透明状液体，有旋光性，略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定，在冷冻干燥配方中，山梨醇常用作填充剂。2 .表面活性剂类表面活性剂是降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。表面活性剂可分为离子型、非离子型。凡是溶于水能电离成离子的，称为离子型表面活性剂，否则称为非离子型表面活性剂。表面活性剂在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变

5、形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。但在冻干生物制品测定和长期储藏中，表面活性剂并没有保护作用。3 .氨基酸类氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中Zui主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸类保护剂有甘氨酸、谷重酸、精氨酸和组氨酸，试验表明氨基酸是的填充剂。低浓度甘氨酸可通过抑制10或IoOmmoI/1磷酸缓冲盐结晶所致PH值的改变而阻止蛋白质药物变性，并且能升高成品的塌陷（崩解）温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。4 .其它添加剂类其它添加剂类保护剂包括抗氧化剂、缓冲剂和冻干加速剂。抗氧化剂：一种是抗氧化剂的自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化；另一种使抗氧

6、化剂给出电子或氢离子，阻断冻干样品中的氧化链式反应；还有一种方式是抗氧化剂通过抑制氧化的活性而防止冻干样品的氧化变质，如维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫眠。缓冲剂：蛋白质具有两性电解质，既能和酸作用又能和碱作用。在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的，由于蛋白质溶液在冻结过程中溶液的浓度是逐渐升高的，所以在高浓度时可改变溶液的PH值，PH值变化4个单位导致蛋白质变性，使生物制品失活。因此在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。如，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠。冻干加速剂：冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。叔丁醇是一种小分子醵，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压。在药品

7、水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可降氐干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短干燥时间；对于难溶于水的药品，可使产品具有较高的比表面积、好的外观，并易于复水，提高药品溶液和冻干品的稳定性，且有一定的抑菌作用。二、冻干保护剂的作用机理（一）冻结过程中低温保护机理优先作用机理认为，蛋白质溶液在达到ZUi大冻结浓度之前，优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥这是由于保护剂的加入增大了水分子的表面张力促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情况下,蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子,从而也就保护了蛋白质的天然构象。优先作用机理并不能完全解释

8、用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。因此，必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。限制蛋白质分子扩散的机理认为,许多保护剂都能够提高溶液的粘度，抑制活性分子的扩散。（二）干燥过程中的保护机理玻璃态假说在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会形成玻璃态。玻璃态分为两种即：强玻璃和弱玻璃。在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃粘度的增加，比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成强玻璃的保护效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因为能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用。水替代假说由于蛋白质

9、分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接。当蛋白质在冷冻干燥过程中推动水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层水合层，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。当冷冻干燥时,保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子冻干损伤。（三）储藏过程中的保护机理干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松驰时间。三、耐热冻干保护剂

10、配方需要注意的问题确定ZUi优的PH值生物制品中的活性成分（如蛋白质）只有在很小的PH值范围内才是稳定的，并且不同的PH环境会影响蛋白质的溶解性。ZUi优的PH环境有利于蛋白质的稳定性和它在溶液中的溶解性,冷冻干燥配方的PH对冻干生物制品长期储藏的稳定性也会带来很大影响。另外，酸碱度会影响固体状态下蛋白质的物理和化学的稳定性。缓冲剂的选择许多缓冲剂能够用于生物制品耐热保护剂配方中,但是并非每一种缓冲剂都能够用于任1可溶液；对PH值敏感的蛋白质溶液,就应当避免使用磷酸钠缓冲液,这是由于在冻结过程中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的PH降低，zui终引起蛋白质变性；正确选择缓冲剂的浓度也是很

11、重要的。填充剂的选择填充剂有相当好的溶解性与生物制品中活性组分相容，没有或者只有很小的毒性，具有较高的共晶温度。低温、干燥保护剂的选择糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用zui频繁的保护剂，一般不选用还原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生非酶褐变反应；某些盐类也要用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂；某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所以常常采用聚合物和糖联合使用，当然，这种方式并不是对每一种蛋白质都是有效的。本研究采用上海亿倍中试机型YB-FD-501进行冻干保护剂效果验证。上海亿倍YB-FD-501机型可实现预冻多阶段控制，预冻温度可调可控；升华阶段及解析阶段可按工艺要求进行制品温度，箱内真空度及升温速率控制。验证过程中证实预冻过程中冻干保护剂达到需求效果关联因素有：冻干设备性能（冻干机隔板均一性，降温速率大小及传热性能等）；冻干工艺是否拟合冻干保护剂性能；冻干保护剂浓度是否正确。