胶体金免疫标记技术资料.docx

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1、胶体金免疫标记技术培训班技术资料一、胶体金的制备根据不同的制备方法，可以制备出直径150Onm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-3Onm范围内。在氯化金（HA1ICk）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的18o以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径316nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法

2、进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.10.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10nm的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂，可以制备12150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备1216nm直径的胶体金。除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿，故般均以小剂量密封保存（0.5g或

3、1g）,因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5m1试管分装为1m1保存（-20C）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长，可4保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。K单宁酸/柠檬酸钠法制备316nm胶体金（1）取一25Om1三角瓶，加入79m1双蒸水和I

4、mI1%氯化金，预热至6070。（2）取一50m1烧杯，加入4mi1%柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25mMK2CO3。预热至6070CK2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5m1时，对PH的影响不大，K2CO3可以省略。（3）将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。柠檬酸钠(m1)单宁酸(1)胶体金(nm)450003420004450064120847010410162、白磷还原法制备5nm胶体金取250m1三角瓶一个，加79m1双蒸水，1m11%氯化金，并用0.25MK2CO3将溶液调至中性(pH7.

5、0)(2)取0.2m1饱和磷/乙醯溶液加到15m1试管中,再加0.8m1乙醛，混匀。取0.7m1加入溶液(1)中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CUSo4进行中和)。(3)室温下轻轻摇匀15min,然后加热沸腾并保持5min,自然冷却。3、柠檬酸三钠法制备12-3Onm胶体金(FrenS,1973)(1)取25OmI三角瓶一个，加IOom1双蒸水及ImI1%氯化金，加热沸腾；(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min,溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。20r20406080So1diameter

6、(nm)注意:（1）由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。（2）胶体金溶液最好保存在4C冰箱中：也可保存在室温卜.，一般可保存12个月。但决不可保存在OC以下，否则金粒子发生凝聚。二、蛋白-金复合体的制备一般认为胶体金粒子表面为一层AUCI2,因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起

7、。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于PH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的PH值，在PH=PI时为中性。由于在PH=P1时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为PH=PI+0.5,这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量

8、分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30kD）,形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是己知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA,牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳PH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同PH值得胶体金结合后，只有某一特定PH值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaQ）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜PH

9、范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜PH值为最佳PH值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。在确定最佳PH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（B1ocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同i蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳PH也有一定变化。因此，在探针制备

10、每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。1、抗血清的前处理一般抗血清中IgG的含量为10-25%,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。大量工作表明，只用硫酸钱沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：(1)取抗血清0.2m1；(2)加生理盐水(0.85%NaCD0.3m1,混匀；(3)逐滴加入饱和(NH4)2S45m1,充分振荡混匀，4静置1h；(4

11、) IoooorPmmin离心20min,弃上清;(5)加0.5m1生理盐水重悬浮，混匀；(6)逐滴加0.25m1饱和(NH4)2SO4,充分振荡混匀,4静置1h；(7) 10000mmin离心20min,弃上清；(8)重复58步骤一次；(9)加生理盐水0.5m1重悬浮，混匀；(IO)生理盐水中透析12-24h；(11)在0.2MPH9.0硼酸缓冲液透析1224h；(12)分装，即将使用时4C保存，备用-20C保存。为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4C下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3MKCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针

12、。2、亲和纯化抗体的处理亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。其基本步骤如下：(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为05-1mg/m1浓度(8) 3MKCNS(硫氟酸钾)溶液中透析12h(3)在2mMo1pH9.0的硼酸缓冲液中透析12h(更换透析液数次)(4)分装备用其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的PH值应与交联时PH值一致。在实际运用中，一般省略去3MKCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。我们建议在

13、制备通用探针(如二抗IgG,ProteinA,ProteinGStreptavidin)等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。3、IgGFab片段的制备一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。IgG分子量为15OkD左右，由4个亚基组成，即两条重链(H)和两条轻链(1)。用水解酸(木瓜蛋白酶)水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。Fc能够与ProteinA

14、和ProteinG特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。其基本过程如下：(1)用PBS(pH7.0,含IomMEDTA,20mM盐酸半胱氨酸)溶解纯化的IgG(2)加固化木瓜蛋白酹(9) 37处理5h(4)离心，去除固化木瓜蛋白酷(沉淀)(5)过ProteinG柱(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理注：Fab与胶体金结合的PH值为6.54、蛋白与胶体金结合最佳PH测定(例纤维素酶，p1未知)(1)取若干个1.5m1试管，分别加入Im1IOnm胶体金；用25mMK2CO3将PH分别调为3,4,5,6,7,8,9,10；取一96孔培养板，按PH从低到高分别将上述胶体金分别取100

15、1加入孔中，重复三次；(4)每孔分别加入31浓度为1mgm1的纤维素酶，混合，室温下放置10/5min；(5)每孔分别加入201浓度为10%NaC1溶液,混合，室温下放置IOmin；(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低PH(X)；(7)重复-(5)步,PH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+k(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。注意：(10) 体金粒子直径较小(36nm),加NaC1需放置较长时间(几个甚至十几个小时后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积(Im1胶体金)，并借助离心来判断。(11) 蛋白最佳PH范围较窄，设置的梯度不能太大。5、最小蛋白浓度的确定(1)用0.22m微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；(2)取一96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳PH的胶体金1001,重复3次;(3)各孔依次加入不同量的蛋白(一般浓度为0.05-0.1mgm1)1201,混匀，室温下放置15min；(4)加入20110%NaC1,室温下放置Iomin；(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。(6)为确保结果准确性，可放大反应体积重更以上步骤。