牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测SOP.docx

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1、PCR法检测BVDV核酸SOP编号：S0P-Z1038-00页码：13版本号：01修订号：00机密等级：秘密起草人起草日期颁发部门质量管理部审核人审核日期批准人批准日期生效日期分发清单研发部质量管理部综合管理部生产管理部市场销售部财务部1. 目的建立血清中牛腹泻病毒核酸PCR检验程序。2. 适用范围初制、精制血清中BVDV核酸PCR的检验操作。3. 职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。3. 2.QC：负责本程序的操作。4. 3.总经理：负责本规程的审批。5. 定义无6. 引用标准无7. 材料及设备8. 1试剂6.1.1.试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司出品）6.1.2,琼脂糖（

2、北京奥博星生物技术有限公司生产）62实验器材1.2.1. 分析天平622.离心机1.2.3. PCR扩增仪1.2.4. 电泳仪、电泳槽6. 2.5.紫外分析仪7. 2.6.微波炉62.7可调移液器(21201200110001)6.3.耗材及玻璃器皿。6.3.1.500m1量筒6.3.2.500m1锥形瓶6.3.31.5m1离心管6. 3.4DEPC处理的1.5m1灭菌的离心管6.3.5吸头10p1、200110001o7. 流程图无8. 内容8. 1样品处理：取IOoU1血清样品、阳性对照、阴性对照放入1.5m1灭菌离心管中。8.2. 病毒RNA的提取1. 2.1.取已处理的样品、阴性对照和

3、阳性对照，分别加入裂解液6001,充分颠倒混匀，室温静止35分钟。1300OrPn)离心30秒8. 2.2.将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液时不要吸到悬浮杂质)，1300OrPIn离心30秒。弃去收集管中液体，套上收集管。9. 2.3.向吸附柱加入6001洗液，1300OrPm离心30秒，弃去收集管中的液体，套上收集管10. 2.4.重复8.2.3步骤。11. 2.5.再空柱13000rpm离心2分钟。8.3. RT-PCR操作程序8.3.1. 每份总体积201,含16.8RT-PCR反应液(用前摇匀)，121酶混合液，2IWRNAo如：n份样品(n10),配制n+1份，16.8

4、X(n+1)RT-PCR反应液，再加入12X(n+1)酶混合液混匀。取181分成n份，分别加入21模板RNA,做好标记。在PCR扩增仪上进行以下循环。：42C45分，953分；扩增条件为94C30秒，5230秒，7230秒，35个循环；72延伸10分钟。84电泳称3克琼脂糖放入500m1锥形瓶中，加入50倍稀释的电泳缓冲液200m1,（取4m150倍电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200m1）,于微波炉中溶解，再加入101染色液混匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后，将PCR扩增产物混合21论上样缓冲液，点样于琼脂糖孔中，以110120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下

5、观察结果。8. 5.结果判定：阳性对照出现341bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现341bp扩增带为牛腹泻病毒阳性，否则为阴性。9. 注意事项91所有物品均应合理处理，以免污染实验室.92PCR整个实验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区一模板提取区、扩增区、电泳区。严禁器材和试剂倒流。93所有试剂应在规定的温度储存，-20C保存的各试剂使用前应室温完全融化，使用后立即放回-20。94染色液低毒，应于室温条件避光保存，操作时应带上手套。95注意防止试剂盒受污染。使用前红盖管8000rpm离心15秒，使液体全部沉于管底，放入冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。10. 附录及派生记录101PCR记录F-S0P-Z1038-01I1相关文件11.1.质量检验超出标准调查分析程序12.修订记录修订号修改内容生效日期