异鼠李素对黑色素瘤细胞形态及活性影响的分析.docx

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1、异鼠李素对黑色素瘤细胞形态及活性影响的分析摘要：异鼠李素属黄酮类化合物，具有预防和抑制心血管及肿瘤等作用。因此，为了探讨异鼠李素抗小鼠黑色素瘤细胞的活性，本文以异鼠李素和小鼠B16黑素瘤细胞为试验对象，对细胞进行体外培养，通过加入不同浓度的异鼠李素，观察其对黑色素瘤细胞形态的影响以及采用MTT法检测其对细胞增殖活性的抑制作用。结果表明，经异鼠李素处理后的细胞出现明显的粘附能力降低、活力下降等现象，细胞增殖明显被抑制。关键词：黑色素瘤细胞；异鼠李素；形态；活性1前言异鼠李素是广泛存在于自然界中的一种黄酮苜元，大量研究表明，异鼠李素具有保护心血管、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗过敏及调节免疫功能等多种药

2、理作用，通常也作为标准品用于测定黄酮含量。黑色素发生形成的整个过程被称为“黑色素生物合成，黑色素合成途径中酪氨酸酶具有多重催化功能，起关键作用。因此，对酪氨酸酶活性的调节和表达水平的调控是影响黑色素生物合成途径和治疗黑色素瘤的重要方式。前期研究中实验室筛选到一些黄酮类物质，异鼠李素、芸香苜、橙皮素等，对酪氨酸酶具有抑制作用，其中异鼠李素的抑制作用最为明显。相关研究表明，异鼠李素在体外对一些肿瘤细胞如1ewis鼠肺癌细胞、人肝癌细胞BE1-7402.人食管细胞系ECa-109等具有细胞毒性，可抑制癌细胞增殖，引起肿瘤细胞凋亡。2材料和方法2.1 材料与仪器设备2.1.1 材料小鼠B16黑色素瘤细

3、胞株（购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库）2.1.2主要试剂与仪器本研究所采用的主要试剂如表1所示。表1主要试剂试剂名称生产厂家PBSHyc1one公司胰酶Hyc1one公司DMEM培养基Hyc1one公司抗生素Hyc1one公司血清依科赛生物科技有限公司二甲基亚飒Amreseo公司异鼠李素Sigma公司MTT检测试剂盒Amreseo公司本研究所采用的主要仪器和设备如表2所示。表2主要仪器和设备仪器设备名称型号制造商倒置显微镜TS1OONIKON,日本超净工作台SW-CJ-2FD上海苏净实业有限公司电子天平A1204-ICMETT1ERTO1EDO高压灭菌锅立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有

4、限公司CO2恒温培养箱I1-185VTSTIK酶标仪BIO-TEKE1X800Thermo离心机Centrifuge5804REppendorf2.1.3其他用品卡式瓶、培养板（6孔、24孔、96孔）、离心管、冻存管、血细胞计数板、移液枪和枪头、试管架、细菌滤器（0.22m）盖玻片、载玻片等。2.2 实验操作方法2.2.1 细胞培养方法2.2.1.1 细胞冻存细胞在培养瓶中培养至对数生长期，弃培养基后用2m1DPBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,待细胞变圆后，继续加入4m1终止液（含10%血清的DMEM培养基）终止消化。吹打，使细胞悬浮，将悬浮液完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25

5、C,IOOOrpm,IOmin）,离心收集细胞。离心后弃上清液，加入1.8m1冻存液（DMEM:血清：DMSO=5:4：1）吹打悬浮细胞后转移至冻存管，程序降温湿盒-80C降温24h,于-80C冻存。（或冻存管置于4CIOmin后，转移至-20降温30min-2h,最后置于-80冻存；-20不宜放置太久，易产生冰晶损伤细胞，30min-2h冻存液冻结即可转移）。2.2.1.2 细胞复苏取冻存细胞于37水浴中快速解冻（适当速度持续晃动冻存管），解冻后悬浮细胞并转移至安剖瓶中，加入5m1新鲜培养基（10%血清、1%抗生素）于培养箱中进行培养（培养箱条件：37、5%CO2）O每天观察，清洗死细胞，更

6、换新鲜培养基，直至生长情况良好后传代。2.2.1.3 细胞传代培养瓶中的细胞弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,继续加入4m1终止液（含10%血清的DMEM培养基）终止消化，完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOmin）,离心收集细胞。离心后弃上清液，加入2m1培养基吹打悬浮细胞后分瓶培养，每瓶加入5m1新鲜培养基于培养箱中进行培养。2.2.1.4 细胞计数将待计数的细胞悬液吹打均匀，用移液枪移取200u1细胞悬液滴到细胞计数板的计数区，盖上盖玻片，不要有气泡，将制好的细胞装片放到荧光倒置显微镜下观察，计算出计数板四大格细胞总数，压线细胞只计

7、算左侧和上方的。然后按下列公式计算：细胞数m1=4大格细胞总数4X104稀释倍数。2.2.1.5 细胞药物处理弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,继续加入4m1终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15m1离心管中，吹打混匀细胞后取200U1细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式：细胞数/4*6*10八4）。离心（离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOmin）收集细胞。离心后弃清液，根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养基，于培养箱中进行培养。表3细胞接种量细胞培养板（孔）接种量（万/孔）培养基（m1）65022437.519

8、670.2接种至细胞贴壁后更换含不同浓度药物的培养基培养。2.2.2异鼠李素对黑色素瘤细胞形态的影响分析2.2.2.1实验原理形态学观察细胞凋亡变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段;胞膜有小泡状形成,膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。2.2.2.2异鼠李素配制称取0.0095

9、g异鼠李素用Im11%NaOH溶解,再用完全培养基定容至30m1,配成ImM的异鼠李素溶液。依次依次用培养基稀释配制成0.5、0.25、0.125、0.0625mM4个浓度，用0.22m针筒细菌滤器过滤。2.2.23细胞培养将上述细胞株用含有10%胎牛血清的DEME完全培养基在37、体积分数为5%Co2、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2天传代1次，实验选用对数生长期细胞。2.2.2.4细胞形态观察调整B16细胞株细胞悬液浓度为1.2X104/孔，加入96孔培养板内，每孔2001,置37、5%的CCh培养箱培养24h。吸除旧培养

10、基，然后加入含不同浓度异鼠李素药物的完全培养基，继续培养48h。再用倒置显微镜观察、拍照记录细胞形态变化情况。2.2.2.5结果与讨论图1异鼠李素作用下黑色素瘤细胞镜检图从图中结果可以看出，未加异鼠李素对照组黑色素瘤细胞结构完整，细胞贴壁能力强，细胞透光性好。添加异鼠李素组从0.0625mM开始黑色素瘤细胞形状和生长状态就发生影响，细胞数量比对照组减少，细胞变皱缩，贴壁能力减弱；在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变圆；异鼠李素0.125mM浓度组发生明显的细胞皱缩凋亡的形态变化；药物作用48小时后，细胞数目明显减少，细胞增殖被抑制。说明异鼠李素可能能够影响细胞集落的形成，并阻碍细胞的

11、黏附、迁移和侵袭。根据显微镜观察结果，还可以发现细胞数量明显减少，并表现出一定的浓度依赖性，且发现B16细胞对异鼠李素较为敏感，较低浓度就出现了明显的不适现象。2.2.3MTT细胞活性检测2.2.3.1实验原理MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(FormaZan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚碉(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。2.23.2 异鼠李素配

12、制称取0.0095g异鼠李素用Im11%NaOH溶解,再用完全培养基定容至30m1,配成ImM的异鼠李素溶液。依次用培养基稀释配制成0.5、0.25、0.125、0.0625mM4个浓度。用0.22m针筒细菌滤器过滤。2.23.3 细胞培养将上述细胞株用含有10%胎牛血清的DEME完全培养基在37、体积分数为5%Co2、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2天传代1次，实验选用对数生长期细胞。2.23.4细胞增殖MTT检测通过MTT染色法检小鼠B16黑色素瘤细胞在不同浓度异鼠李素作用下的存活率。调整B16细胞株细胞悬液浓度为1.2X

13、104/孔，加入96孔培养板内，每孔2001,置37、5V%的CCh孵箱培养24h。吸除旧培养基，分别加入含不同浓度异鼠李素的10%胎牛血清DEME培养基，并设空白对照组和调零组，每组均设5个复孔，继续培养48ho于结束前4h,加入MTT溶液(5mgm1)201孔，4h后吸出上清液,加入501DMSO溶液,振荡IOmin,使结晶充分溶解。在570nm处用酶标仪检测各孔的吸光值。计算细胞增殖抑制率。实验重复3遍以上。细胞增殖抑制率=1-(加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值)X100%o2.23.4 5结果与讨论结果图1显示，随着异鼠李素浓度的升高，细胞

14、的存活率下降。当异鼠李素浓度为ImM时，细胞存活率为28%。异鼠李素对黑色素瘤细胞株(B16)细胞增殖显示了较强的抑制作用。根据试验所得数据,分析发现异鼠李素浓度0.25mM以下，细胞活力随异鼠李素浓度变化大，且当浓度达到0.25mM时，细胞存活率即下降到35%左右；而异鼠李素浓度0.25mM-1mM之间，细胞存活率变化并不大，推测异鼠李素能够有效防治黑色素细胞瘤，但并不能完全阻断黑色素细胞瘤的发生。异鼠李素浓度(m.M)图2异鼠李素对黑色素瘤细胞增殖的MTT测定注：*是指pO.O5,(兴)s思3小结近年来食品污染、装修污染、水源和大气污染等环境因素使恶性肿瘤患病率逐渐上升，虽然手术、化疗、放

15、疗以及生物治疗等手段使其生存率有较大提高，但治疗效果仍不理想。不少黄酮类化合物对CYP酶有较强的抑制作用，该作用也是某些黄酮类化合物预防和抑制肿瘤的重要机制之一。本研究建立在植物来源的异鼠李素及黄酮抗肿瘤前期研究的基础上，研究认为黑色素瘤细胞对异鼠李素非常敏感，并且异鼠李素对黑色素瘤细胞具有增殖抑制和凋亡诱导的双重调控作用，为后期研究异鼠李素对黑色素瘤细胞的调控作用机制提供了方向和理论基础。可以相信，今后将会有更多的植物黄酮陆续被开发成为新型药物，其市场前景无限广阔。参考文献朱玲,王正荣,周黎明,等.异鼠李素对肺癌的作用及其抗肿瘤机制的初步探讨J.航天医学与医学工程,25,18(5):381-383.胡珊,邓甬川.异鼠李素对乳腺癌细胞的作用机制J.中国药科大学学报,2013,44(6):563-567.3朱玲.异鼠李素体内外抗肿瘤作用及其机制的研究D.四川大学,2005.何佳珂,于洋,陈西敬,等.黄酮类化合物的药物代谢研究进展J.中国中药杂志,2010,35(21):2789-2794.5滕丹滦新尧.异鼠李素的药效学研究进展J.中医药临床杂志,2016,28(4):593-596.谭琪,明胡丹.