过表达ABAD对Aβ1-42刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响.docx

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1、过表达ABAD对AB2刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响洪婷婷张宇崔理立()广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001【摘要】目的探讨Api/刺激下，在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响及自噬相关标记蛋白水平的变化。方法293T细胞分别经APM2(5M10M20M)处理后，ATP试剂盒测定其细胞ATP含量；活性氧试剂盒测定其活性氧生成量。自噬诱导剂处理后，WeSternbIot观察线粒体自噬相关蛋白表达量的改变。通过标准曲线换算ATP细胞含量和活性氧生成量，用ImageJ对WeSternbIOt条带进行量化。结果对照组与293T过表达ABAD组ATP

2、含量和活性氯生成量无明显差异(P均0.05)；与不给药组相比,在给予Aj2(IOuM)刺激后，293T细胞过表达ABAD的ATP含量减少，差异具有统计学意义(P0.05)；与DMSO处理对照组相比，CCCP自噬诱导剂处理组在Apb42IOuM诱导后线粒体自噬相关蛋白P62降低、1C3B升高，差异均有统计学意义(PvO.O5)o结论过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，但在特定浓度A,42刺激下可影响线粒体ATP产生及促进线粒体自噬发生。【关键词】：ABAD,A,线粒体功能：线粒体自噬；【中图分类号】R74【文献标识码】AEffectsofoverexpressionofABADonmi

3、tochondria1functionandautophagyof293Tce11sstimu1atedbyA,42HONGTing-tingZHANGYuCUI1I-1i*Guangdongprovincia1key1aboratoryofagere1atedheartandbraindiseases,GuangdongMedica1UniversityZhanjiang524001,Guangdong,ChinaAbstractobjectivetoinvestigatetheeffectofoverexpressionofABADonmitochondria1functionandthe

4、1eve1ofautophagy-associatedmarkerproteinin293Tce11sstimu1atedbyA32Methods293Tce11sweretreatedwithAp42(5uM,IOuM,20uM)respective1y,andtheirATPcontentwasmeasuredbyATPkit,andtheproductionofreactiveoxygenspecies(Ros)wasmeasuredbyRosKit.Aftertreatedwithautophagyinducer,theexpressionofMitochondria1autophag

5、y-re1atedproteinswasobservedbyWesternb1ot.TheamountofATPce11sandreactiveOxygenSpecies(Ros)wereca1cu1atedbystandardcurve,andtheWesternb1otwasquantifiedbyImageJ.Resu1tstherewasnosignificantdifferenceinArPcontentandreactiveoxygenspeciesproductionbetweenthecontro1groupand293Toverexpressionabacigroup(P0.

6、05);comparedwiththecontro1group,theATPcontentof293Tce11soverexpressionABADwasdecreasedafterAm2(IOuM)stimu1ation,thedifferencewasstatistica11ysignificant(P0.05);comparedwiththecontro1grouptreatedwithDMSO,mitochondria1autophagyre1atedproteinP62decreasedand1C3BincreasedinthegrouptreatedwithCCCPautophag

7、yinducerafterAB.42(IOuM)stimu1ation(PBCA蛋白检测盒（美国ThermO公司），ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒（上海毅乐生物），增强型ATP检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术），CCCP（MCE）,A1.42（上海强耀生物科技有限公司），DMSO（青岛生物科技），抗体：1C3B（Sigma）,P62、ABAD（Abcam）,P-actin（CST）,低温高速速离心机（德国Eppendorf公司），酶标仪、化学发光仪（美国Thermo公司），曝光机（美国AzureBiosystems公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组293T细胞购买

8、于上海中乔新舟生物公司，使用完全培养基（10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基）在37、5%C2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞，每隔23d传代1次，用含EDTA胰酶消化3min,加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组为1、正常组、ABAD过表达组、正常给药组（Ap.425uMIOUM、20uM）、ABAD过表达给药组（A425uMIOuMs20uM）1.2.2 细胞转染严格按照汉恒1iPOFiter说明书转染。细胞传代3次后，按IxIO5/孔接种，细胞培养箱中培养24h,在细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和ABAD干扰转染终浓度为2ug孔。转染5-6h后，

9、更换新的培养基继续培养。24h后，用配制的不同浓度APy2刺激细胞24h1）1.2.3 A阮42的配制AB2母液配制：取人源A2单体，用HF1P重悬，在通风橱中挥发后获得A。肽膜，以DMSO溶解肽膜，稀释至适当浓度后，37孵育48h后即得到AB寡聚体，孵育后的溶液1周内使用。1.2.4 CCCP的配制CeCP母液配制：离心试管，在无菌操作台中称取适量CCCP粉末，加入DMSO,使浓度为20mM,充分震荡混匀离心，即得到CCCP母液，1月内使用。1.2.5 ATP检测按照产品说明书操作，吸除培养液，10OU1裂解液/12孔板每孔，移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4C12000g离心5min,

10、吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需IoOU1ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1:4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加IoOU1ATP检测工作液到检测管内，室温放置5min。检测管内加上20U1样品/标准品，迅速用枪混匀，间隔2s后，用化学发光仪测定R1U值。1.2.6 ROS检测按照产品说明书操作，用无血清培养液稀释DCFH-DA(GoOO),使终浓度为10微摩尔/升。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，细胞浓度控制在约一百万至二千万/m1,37细胞培养箱中孵育2

11、0min。隔5min上下颠倒混匀，待探针和细胞充分接触后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。1.2.7WesternB1ot移除培养液，用冰PBS小心洗一遍，按IoOUI裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于摇床冰上，裂解15min,用细胞刮充分刮数下，收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60V,待蛋白条带入分离胶，调整电压至IoOV),预先将PDVF膜泡在甲醇液中5-1Omin,待电泳结束，将其转印至PVDF膜，赶走膜和胶之间的气泡，放

12、入转膜槽(IOOmA,10Omin),IXTBST稀释的5%脱脂牛奶，摇床上常温封闭1h。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育，(一抗稀释液配制所有的一抗，浓度为1:1000),4度摇床过夜。回收一抗，1XTBST洗膜三次，IOmin/次。二抗用IXTBST稀释的5%脱脂牛奶溶解，与膜在摇床上常温孵育1h。IxTBST洗膜三次，1Omin/次。显色及曝光。将归一化后目标蛋白灰度值与内参-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。1.2.8 统计方法所有实验重复至少3次。用GraPhPadPriSm6.0对实验结果进行统计分析。表中数值均为平均值土标准误差(-s)o数据采用单因素方差分析(ANOVA)或者t检验进行分析。P0.05表示差异有统计学意义。2结果1、在293T细胞过表达