污水厌氧处理技术.docx

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1、污水厌氧处理技术四环素是一类水体中常见的广谱抗生素,它能与核蛋白体的30S 亚单位结合,阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合割制蛋白质的合 成。同时,四环素类药物的广泛使用引起了四环素耐药细菌在环 境中产生并快速传播。至今,被发现的四环素耐药细菌有115属、 530种。不同来源废水中四环素的含量差异较大,一般含量在几 十ngL-l到几百gL-l之间。近年来,四环素对污水处理系统的 影响引起了广泛关注。Cetecioglu等在sbr中通过测定cod 的含量和气体的产量的变化发现，当四环素投加量低于 8.5mgL-l时,反应器内底物降解作用不受影响,但产气量减小了 10%20%,说明四环素对系统中微生

2、物造成了影响。AYDIN等 在ASBR中通过测定甲烷产量和挥发性脂肪酸的积累量的变化 发现,不同浓度组合的四环素、红霉素和磺胺对同型乙酸菌和产 甲烷菌产生了不同程度的影响。AYDIN等在随后的研究中又分 别运用了 real-timePCR和PCR-DGGE分子生物学技术发现,四 环素、红霉素、磺胺3种抗生素共同影响下产乙酸细菌和产甲烷 古菌存在互营关系且这种互营关系对反应器的稳定运行起关键 作用。随着分子生物学技术的发展,高通量测序技术已被广泛使用在研 究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落结构中。第2代 IIIuminaMiSeq高通量测序能克服传统检测方法的缺陷,具有通 量高、错误率低、成本低

3、、流程自动化、速度快等优势,目前已 在研究微生物多样性群落结构方面受到广泛认可；因止匕，将 IIIuminaMiSeq高通量测序方法应用于污水处理系统的研究,对 深入认识污水处理系统具有实际意义。当前,污水厌氧处理因其高效能、低能耗等特点在污水处理工程 上开始受到关注。它实际上是借助于不同微生物种群间的协同作 用,通过水解一酸化（产氢及产乙酸）一产甲烷等一系列生物反应 将有机底物转化为甲烷和无机物的过程。在这个过程中,微生物 群落构成直接影响到污水处理的效果,因此,深入认识污水厌氧消 化系统的微生物群落构成,对厌氧污水处理系统的稳定运行具有 指导作用。基于此,本研究通过室内模拟实验,选择ABR

4、多相厌氧反应器进 行连续流实验启动反应器达到稳定状态后,分别在不含四环素和 含有250gL-l四环素的人工配制污水条件下运行90d,通过考 察来自反应器的氢气、甲烷产生量的变化,运用IIIUminaMiSeq 高通量测序方法对反应器中的微生物群落构成进行分析,研究四 环素对污水厌氧处理系统微生物群落造成的影响,以期从微生物 关系角度深入了解这种影响,为污水厌氧处理技术研究及工程实 践提供参考。1、材料和方法1.1 实验装置ABR采用厚为5mm的有机玻璃板加工制成,尺寸为455mm 15OmmX40Omm,有效容积为21L置于(351)。C的恒温箱中。反应器分为3个格室,按照前后顺序分为格室1、

5、格室2、格室 3,分别命名为CL C2、C3,每个格室由上、下流室(体积比为3: 1)组成,折流板底角为45oo格室体积比Vl : V2 : V3 = 1.5 : 1 : Ie 每个格室上部设有集气口,侧部分别设有取水口、取泥口。1.2 接种污泥接种污泥取自某市沥窖污水处理厂A2/O工艺的厌氧池。污泥 MLSS = 24.67g L-lzMLVSSMLSS = 0.61zpH = 6.58z 含 水率为 97.30%o接种污泥体积为反应器有效容积的l3o1.3 实验用水配水以葡萄糖为碳源,NH4CI和KH2PO4分别为氮源和磷源洞时加入Ca、Mg、Fe. Co. Ni等微量元素,以保证微生物细

6、胞合 成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHC03以保证ABR 内的缓冲能力。反应器以连续流方式进水,水力停留时间(HRT)为24ho在启动阶 段，采用逐步增加进水负荷的启动方式，进水COD浓度为 5002000mgL-l,当COD去除率稳定在80%以上、出水各项 指标(pH、碱度、VFA)趋于正常,启动阶段完成。反应器的运行 先后经历了启动阶段(56d)、稳定运行阶段(90d)、添加四环素 (250gL-l)运行阶段(90d)。1.4 DNA的提取和PCR扩增及其微生物多样性数据分析分别在反应器的稳定运行阶段和添加四环素运行阶段每间隔 18d从每个格室采集一次活性污泥样本,分别命名为Ct

7、rlDI8C1、 CtrlD36Cls CtrlD54Clx CtrlD72Clx CtrlD90Clx TreD18Clx TreD36Clx TreD54Cl. TreD72Clx TreD90C1,其中Ctrl 代表未添加四环素运行时的污泥样本， Tre 代表添加四环素运 行时的污泥样本，D18代表第18天取样，C1 代表样本取 自格室L格室2和格室3的样本命名为C2和C3o实验共从3 个格室中共采集到30个活性污泥样本。分别称取0.4g污泥用 于DNA提取。采用MOBIOPowerSoilDNAIsolationKitDNA 提取试剂盒进行 DNA提取,提取步骤依据说明书操作,提取好的

8、DNA保存于-20。C冰箱。以提取的基因组DNA作为模板,使用16SrRNA基因V4区特异 性引物F515和R806进行PCR扩增,扩增片段长度约为300bpo 本实验采用50L的PCR反应体系:lpL模板,各lL的10 molL-l正向引物和反向引物反大),0.2L20mgmL-0的蛋白 质(TaKaRa)z25L的Prem IxExTaqVersion (ExTaq Versio 2.Op Iusdye) (Ta Ka Ra)z21 .8L 灭菌水(TaKaRaK PCR 的反应条件:945min;9430s,52 30sz72oC45sz31个循环;72。Clomin。将各样品的PCR产

9、物按照 等 摩 尔 量 进 行 混 合，使 用 QIAqUiCkGelEXtraCtiOnKit(Qiagen,Chatsworth,CA, USA)凝胶 回收试剂盒切胶回收PCR混合产物,并用1%的琼脂糖凝胶电泳 检测,最后使用IIIuminaMiSeq高通量测序平台进行基因测序。测序结束后,首先,使用TrimmOmatiC(VerSiono.33)软件去掉序 列3端连续的低质量碱基。接着,用MOthUr(VerSionL35.1)中 的make.Contigs命令将两端reads拼接成完整的目的DNA 片段,再用screen.seqs , trim.seqs命令进行错误序列的 识别和修剪。

10、最后,使用QnME软件对测序数据进行微生物的多 样性分析,将得到的序列进行聚类,将97%相似性的序列聚类成为 OTus(Operationaltaxonomicunits)。物种分类由UCLUST(Version 1.2.22)软件和 GreengenesOTU 数据库 (gg_13_8_otus)实现。1.5 反应器气体产生的分析于固定时间每6d测定一次格室内产生气体中氢气和甲烷的含量, 检测方法为气相色谱法。使用仪器为安捷伦782OA气相色谱仪， 检测器为TCD,色谱柱为TDX-OL色谱条件如下:进样口、色谱柱、 检测器的温度分别为100. 100和200。载气为氮气,流量为 35mLmi

11、n-l;进样量为 ImLo2、结果和分析2.1 四环素对反应器内气体产生的影响ABR3个格室中氢气的产生情况如图2所示。仅在格室1中检测 到氢气的存在,而格室2和格室3中没有检测到氢气的产生,这主 要是由于格室1进行的是产氢产乙酸反应,而后端格室主要进行 的是产甲烷反应。未添加四环素运行时,格室1内氢气的平均产 量为00102L(gd)T(以MLSS计)。添加四环素后,氢气产量是 未添加四环素时氢气产量平均值的4.056.89倍。说明四环素 的添加能使氢气产量增加。ABR3个格室甲烷产生情况,如图3所示。在未添加四环素时,格 室L格室2、格室3的甲烷平均产量分别为0.3204、0.1462、

12、0.0881L(gd)T(以MLSS计)。显然,甲烷产量在纵向上呈降低 的趋势。这与反应器内的底物分配有关,格室1进水有机物含量 较高,随着格室内微生物的降解作用,有机物含量在纵向上随着格 室逐渐降低,有机物的减少使得甲烷产量在格室间纵向减小。添 加四环素后,格室1、格室2、格室3的甲烷产量随着运行时间的 推移呈现不同程度的下降,分别是未添加四环素时对应甲烷平均 产量的 4390%8020%、 2728%7979%、 38.24%83.70%o 通过对比四环素添加后同一个格室不同时间的甲烷产量变化,发 现甲烷产量随着运行时间的推移呈现下降趋势,说明四环素对产 甲烷的抑制作用随着时间的推移增大。

13、2.2 微生物丰度分析通过反应器中获取的DNA序列与GreengenesOTU数据库进行 比对,得出反应器中微生物主要有16个属,如图4所示。分别为 甲烷杆菌属(MethanobaCteriUm)、密螺旋体属(TrePOnema)、 寡养单胞菌属(StenotroPhomonaS)、不动杆菌属 (Acinetobacter) x 脱硫弧菌属(DesuIfovibrio) x 长绳菌属 (LongiIinea) x丛毛单胞菌属(Comamonas)、互营杆菌属 (Syntrophobacter) x 梭菌属(CIostridium) x 浮霉状菌属 (PIanctomyces) x Blvii2

14、8 x Paludibacter x AUTHM297 x WCHB1-O5s AI7、W22o图4可知,随着四环素的添加,不同物种呈现出不同的变化趋势。 其中,随着四环素的添加,密螺旋体属(TrePonema)、脱硫弧菌属 (DesuIfovibrio)x 互营杆菌属(SyntroPhobaCter)、W22 的丰度 在3个格室内均呈现增长的趋势,说明密螺旋体属(TrePonema)、 互营杆菌属(SyntroPhobaCter)、脱硫弧菌属(DeSUlfoVibrio)、 W22对四环素具有一定耐药性。密螺旋体属(TrePonema)能利用氢气和二氧化碳转化成乙酸。添 加四环素后,如表1所

15、示,格室L格室2、格室3内的密螺旋体 属(T reponema)分别是未添加四环素时相应密螺旋体属 (TrePonema)平均丰度的 L092.00 倍、1.271.79 倍、 1.41-6.52倍,密螺旋体属(TrePonema)丰度的增加说明四环素 的添加能促进氢气和二氧化碳转化成乙酸的过程,有利于乙酸的 积累。有研究表明,乙酸是微生物燃料电池生产电能的首选底 物,It生物质可产出价值150美元的乙酸,却只能产出31美元的 甲烷；因止匕,在处理四环素污水时，可以充分利用密螺旋体属(TrePonema)的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,

16、实现资源回收。互营杆菌属(SyntrOPhobaCter)是一类产氢产乙酸细菌,能将高 级脂肪酸和醇类氧化分解为乙酸和H2o添加四环素后,如表1所示,除了格室1第18天和格室3第54天 的互营杆菌属(SyntroPhObaCter)比未添加四环素时平均丰度低, 这可能是由于反应器运行过程中其他条件扰动引起的,其他时间 内格室L格室2、格室3内的互营杆菌属(SyntrOPhobaCter) 分别是未添加四环素时相应互营杆菌属(SyntroPhobaCter)平均 丰度的L372.04倍、LOo3.95倍、L482.98倍,互营杆菌 属(SyntroPhC)bacter)丰度的增加说明四环素的添加有利于产氢 过程,与2.1中氢气产量增大的结论相印证。氢气是一种清洁能 源,具有燃烧热值高、燃烧产物无污染的特点,具有很好