用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能.docx

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1、摘要：项目研究内容和意义简介(限400字RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性的InRNA降解所致的转录后基因沉默过程。RNAi技术可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的筛选。本课题拟采用RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术，将我室新克隆的精子发生相关基因znf230的SiRNA通过慢病毒(1entivirus)系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发生过程，而在细胞水平上研究znf230基因表达受抑后对生精的影响，同时结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。上述技术平台的建立将提供

2、一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。报告正文(一)立项依据与研究内容(4000-8000字)：1 .项目的立项依据(附主要的漆考文就5成)人类基因图谱解码已经完成。进入功能基因组学时代后，疾病相关基因以及重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。而随着新基因的分离与鉴定，对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。因此，建立或开发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。在功能基因组研

3、究中，酵母杂交系统、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(geneknock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功能研究的经典技术，但由于外源及靶DNA发生同源重组的几率极低，重组体的筛选及检测即成为该技术的瓶颈，难以适应大规模的基因功能研究。近年来发展起来的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方法，已成为生命科学领域研究的热点。其优点是可以简便地制备特定基因缺失表型的个体，较快捷地研究目的基因的功能，并使系统性、高通量功能基因筛选成为可能。RNAi现象首先在秀丽新小杆线虫(Ce1egans)中被发现。它通过双链RNA(

4、doub1e-strandedRNA,dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解，在转录后水平使基因沉默(POStTranSCriPtiona1GeneSi1encing,PTGS)僧叫RNAi技术现己成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中H巩而在哺乳动物细胞内转染21-25nt长度的siRNA也可以诱导特异性的基因沉默，虽然这种效应具有瞬时性。目前，多个研究小组0己将靶向特异基因的ShRNA表达质粒导入细胞，在聚合酶H1依赖性H1或U6启动子控制下获得siRNAs的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调，这为RNAi用于长期功能缺失型研究提供了新的思路。然而，目前在

5、RNAi应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决，如：1) ShRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的RNAi效应，但多数仍呈瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的“knockdown”效应。2)并非所有的组织或细胞的靶基因对RNAi敏感；某些基因的表型鉴定本身就存在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。3)目的基因序列上SiRNA模板的选择无统一标准。实际操作中往往是试探性的，选择不同序列RNAi效应差别大，抑制率可从090%不等。因此，建立高效、稳定长期表达的RNAi传递系统正是该领域目前研究的关键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达，但M

6、M1V类病毒自身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。当前，新型第三代慢病毒(1entiVirUS)系统正以其高效、稳定的特性在RNAi研究中倍受关注。1entivirus来源于H1V-I病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细胞等，且转基因在生殖系统中可稳定传递【。Pfeifed4等的研究结果表明，1entivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(EmbryOniCStem,ES)体内、外分化过程中表达，将1entiVin1S感染的ES细胞注入胚泡期或桑根期胚胎，发育的新生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。TiSCOrnia等将沉默GFP的1entivir

7、us感染GFP阳性转基因鼠卵细胞，发现新生鼠体内GFP荧光蛋白的表达明显降低。RUbiSOn【等运用CD8CD25siRNA的1emiVirUS载体转染鼠ES细胞，生成了“knockdown”转基因鼠，其效应维持长达30天之久并可传递下一代，充分显示了该方法的优越性。精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程,涉及生精细胞的生长、分裂、分化和信号传递等，要求一系列基因表达的精确调控“加%这些基因的异常将导致精子发生障碍，表现为寡精症或无精症。近年来我室分离克隆了一系列可能与精子发生相关的基因U”?,目前己初步阐明了这些基因的结构与表达,如ZNF230在无精症患者睾丸组织中无表达,znf230在小

8、鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞(SPermatid)形成阶段起重要作用Y由于生精过程极其复杂，这些基因的调控及其生物学功能尚未明了。为探索此类问题，首先需建立供研究的模型系统。2003年末，ToshiakiNoce研究小组成功地将小鼠ES细胞在体外定向分化成精子。研究中，悬浮培养的ES细胞在BMP4刺激及拟胚体立体空间构型的影响下向原始生殖细胞(PrimOrdiaIgermce11s,PGCS)分化，具PGCs性质的ES细胞aggregation移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。此外，Da1ey及GeijSen等研究小组【24】也报道了ES细胞体外分化成精子的新进展。基于以上RNAi研

9、究所取得的成果，结合鼠ES细胞体外定向分化新技术，我们设想如能将1entivirus系统引入小鼠ES细胞使之长期稳定表达、发挥RNAi效应，则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况，进而确定其功能。因此,可将ES细胞在体外定向分化成精子，即体外模拟精子发生过程，在细胞水平上研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响，以期全面研究该基因的功能。鉴于此，本课题在前期研究工作的基础上，拟运用生物信息学及RNAi载体构建新技术对我室新克隆的基因znf230(GenBankID:AF353167)进行有效siRNA序列筛选、靶位证实，生成高效表达的1entiVirUS载体系统并引入小鼠ES细胞，阻

10、断znf230的表达(6个有效的ShRNA串联片段使RNAi抑制率至少达90%以上)。在精子体外分化模型的细胞水平上，为了有效地获取精子发生过程中znf230相关基因的表达、网络调控及其功能信息,将结合基因表达谱芯片技术的高通量、快速、敏捷、平行性等特点，对照研究znf230表达被抑后表达谱的变化，以实现高通量的基因功能性筛查；同时运用经典的蛋白组学二维电泳质谱技术来研究znf230被抑制后的蛋白表达变化，实现对蛋白质的表达进行原位筛查，以期分离鉴定有功能意义的蛋白。目前国内对RNAi的研究刚刚起步，我们利用1entivirusRNAi系统建立的znf230基因功能研究方法，在设计理论与技术上

11、均与国际上的有关研究位于同一起点。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。参考文献1. 1ockhartPJ,O1Farre11CA,FarrerMJ.Itsadoub1eknock-out!Thequakingmouseisaspontaneousde1etionofparkinandparkinco-regu1atedgene(PACRG).MovDisord,2004,19(1)

12、:101-104.2. ZamorePD,Tusch1T,SharpPA,andBarte1DP.RNAi:Doub1e-strandedRNAdirectstheATP-dependentc1eavageofmRNAat21to23nuc1eotideinterva1s.Ce11,2000,101:25-33.3. HammondSM,BemsteinE,BeachD,HannonGJ.AnRNA-direc1ednuc1easemediatespost-transcriptiona1genesi1encinginDivsophiace11s.Nature,2000,404:293-296.

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