抑制eIF2α去磷酸化对肝细胞中c-Met表达的影响及意义研究.docx

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1、抑制eIF2去磷酸化对肝细胞中C-Met表达的影响及意义研究何毅怀风杨雪梅A蒋小铃A黄美颖母、冯素敏2、陈欢2(I.遵义医科大学附属医院a.感染科;b儿科；2.遵义市第五人民医院内三科贵州遵义563000)摘要目的:本研究探讨肝细胞真核细胞起始因子2(eukaryoicinitiationfactor2a1pha,eIF2)信号对促肝细胞生长因子受体(C-Met)表达的影响、机制及意义。方法：首先通过内质网钙平衡抑制剂毒胡萝卜素(IhaPSigargin,TG)诱导人肝细胞株102细胞内质网应激(endop1asmicreticu1umstress,ERS)：随后给予c!F2去磷酸化抑制剂Sa

2、IUbrina1预干预TG诱导的102细胞，采用CCK-8检测细胞活力，蛋白免疫印迹法检测eIF2a、磷酸化的eIF2(peIF2)羟甲基戊二酰辅的A还原前降解蛋白I(HMG-COAredUC1aSedegradation1,HRDh标志内质网相关降解)及C-MC1蛋白水平的变化。实验结果通过独立样本T检验或方差分析。结果：(I)TG呈时间依赖性上调102细胞eIF2的磷酸化(I0.19,2.84(M5,6.39土0.28,15.65土1.41,F=396.691,P0.001)及HRD1(10.17,4.680.37,10.251.26,13.491.26,F=185.7()6,P0.()(

3、)1)蛋白水平；(2)TG呈时间依赖性下调C-MCI蛋白水平(IOI9,0.510.44,O.27O.O5,0.190.04,F=6O.85,P0.001)及肝细胞增殖活力(P0.05);(3)相比TG组，加入Sa1Ubrina1预干预后，显著增加TG诱导的eIF2磷酸化水平(1()16,2.240.25,P0.05),下调XBP1S(10.07,().510.()2,P0.()5ERS压力负荷)、HRD1(1.070.07,0.680.03,尸0.05)蛋白水平,部分恢且C-Met表达(I土0.20,4.250.31,P0.05)及肝细胞增啜活力(69.851.25,77.32.18,a0.

4、05M&均)。结论：在ERS中，SaIUbrina1抑制cIF2a去磷酸化部分恢友肝细胞cMci表达，促进细胞存活，其机制可能与反做减轻ERS有关。关键词：内质网应激；c-Met：Sa1ubrinah肝细胞增殖中图分类号：R575EffectandmechanismofinhibitionofeIF2dephosphory1ationonc-MetexpressioninhepatocytesHEYihuan,YANGXucmci,JIANGXiao1ing,cta1.(DepartmentofInfectiousDiseases,TheAffi1iatedHospita1ofZunyiMed

5、ica1University,Zunyi,Guizhou563003,China)Abstract：Thepurposeofthisstudywastoexp1oretheeffect,mechanismandsignificanceofthephosphor)*Iaiionofeukaryoticinitiationiactor2(e1F2a)ontheexpressionofhepatocytegrowthfactorreceptor(c-Met).Inthisstudy,102ce11swasemp1oyedtoexp1oretheeffectsofChapsigargin(TG)-in

6、ducedendop1asmicreticu1umstress(ERS)onit.Thece11pro1iferationactivitywasde1ectedbyCCK-8assay.TheexpressionofPhoSPhoryIa1cdCUkaryo1iCIrans1ationinitiationfactor2(p-eIF2a),c-MetandHMG-CoAreductasedegradation1(HRD1)weredetectedbythemethodofwesternb1otting(WB).TheeffectsofspecificeIF2dephosphory1ationin

7、hibitorSa1ubrina1ontheTG-induccdERS-rc!a1edproteinsandc-Mctandthepro1iferationactivityofhepatocyteswereinvestigated.Theexperimenta1resu1tsweretestedbyindependentsamp1eTtestorana1ysisofvariance.Resu1ts:i.TG-inducedERSUpregu1atedtheproteinexpressionofp-eIF2(j土0.19,2.840.15,6.390.28,15.65土1.41,尸396.691

8、P0.001),HRD1(10.17.4.680.37,IO25土1.26,13.491.26,F=185.706,P0.001)inatime-dependentmanner.2.TG-inducedERSdown-regu1atedc-Metprotein1eve1s00.19,0.51土0.44,0.27土0.05,0.19004,尸=60.85,P0.1)andce11pro1iferationactivity(P0.05).3.ComparedwiththeTGgroup,theadditionofspecificeIF2dephosphory1a1ioninhibitorSa1ub

9、rina1significant1yincreasedtheexpressionofP-CIF2豆().16.2.24土0.25,P0.05).down-regu1atedXBPIS(I0.0X0.51土0.02,P0,05)andHRD1(1.070.07,0.680.03,PCO.05).partia11yreversedthedownwardtrendofC-Me1(10.20,4.25士0.3.尸0.05)，andpartia11yrestoredthepro1iferationactivityofhepatocy1es(69.851.25.77.312.18,P0.05).Conc1

10、usion:InhibitionofcIF2dcphosphory1ationmayreduceendop1asmicreticu1umstress-mediatedc-MetexpressionbyreducingERS-re1ateddegradationinhepatocytes.Keywords:endop1asmicreticu1umstress;c-Meusa1ubrina1;hepatocytepro1iferation肝衰竭包括急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭，它们的死亡率在40%-80%之间。肝损伤发展为肝衰竭与其病因、诱因、低下的肝细胞抗损伤能力和肝细胞

11、再生能力相关，故增强肝细胞抗损伤能力、促进肝细胞增殖是治疗肝损伤的基本策略。促肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactorreceptor,HGF)受体C-Met是受体酪氨酸激的家族中类独特的亚族，对细胞生长转化、细胞周期、细胞的抗损伤能力及增殖均具有重要作用口21口。有研窕发现C-MC1在急性肝功能哀竭中能促进代偿性肝再生，提示C-MCI有望一城代码已更改成为是治疗肝病的靶点国R内质网应激(endop1asmicreticu1umstress,ERS)是细胞的防御机制之一，影响肝细胞增殖，与肝病的发生发展密切相关。我们前期研究发现ERS可下调-Mc1的表达，影响肝细胞增殖国图

12、。内质网是细胞内合成蛋白质、肽处折叠、修饰及脂类、糖类合成的重要场所，内质网还通过对钙的贮存与释放参与细胞内钙岗子浓度的调节。当各种病理、生理因素引起内侦网稳态失衡，使内质网腔内未折叠蛋白、借误折叠蛋白聚集，钙离子浓度改变时，可诱导ERS-ERS通过蛋白激的R内质网激龄(ProtCinkinaseR-Iikckinase,PERK)/真核细胞起始因子2(eukaryoticinitiationfactor2a1pha.eIF2a)、需肌醉激酣IRnosiio1requiringenzyme1,IREI)/X盒结合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP1)、活化转录因子6(ac

13、tivatedtranscriptionfactor6,ATF6)三条信号通路，最终通过减少新生蛋白的合成、激活内质网相关降解(endop1asmicreticu1umassociaieddegradation,ERAD)减轻内质网的压力,恢且内质网稳态3现有研究表明ERS对细胞增殖存在广泛影响。JoSePh等发现，UPR激活可通过PERK触发细胞周期阻滞，现已证实这可能与CyeIinD1下调、细胞周期检测点激的I(ChkD活化、GaSPin蛋白磷酸化有关。IoERS影响增殖，与肝病的发生发展密切相关。但ERS影响肝细胞增殖的具体分子机制尚不明确。口前尚且没有报道ERS影响C-MC1表达相关机

14、制研究，故本研窕基于前期研窕基础应网，进一步探讨ERS中eIF2信号对C-Met表达的影响的潜在机制及意义。1材料与方法1.1 主要试剂与材料正常人肝细胞株102购自中国科学院。本研究经由遵义医科大学附属医院伦理委员会审批批号：伦审20232-321号。胎牛血清(Gibco):RPM11640培养基(HyCk)ne)：百链毒素混合物、0.25%胰痢(索莱宝)；DMSO试剂(AmreSCo)；毒胡萝卜素(Ihapsigargin,Sigma-A1drich):Sa1ubrina1(Sigma-AIdrich);cIF2a、C-MCI单克隆抗体(SantaCruz)：P-C1F2a、XBPIS单克

15、隆抗体(Ce11Signa1ing)：HRD1(SAB,Sigma),GAPDH多克隆抗体(ETI601-4)；电泳仪及电转仪(Bio-Rad)；倒置显微镜(Nikon)；高速冷冻离心机(Sigma)t.1.2 药物制备1.2.1 毒胡萝卜素溶液配置ImgTG溶于1.537m1DMSO中(含Img/m1TG母液)，使用浓度为0.5IiM,-20C保存。1.2.2 Sa1ubrina1溶液配置5mgSa1ubrina1溶于208.41DMSO(含50mMSa1ubrina1母液)，使用浓度为20M,-20C保存。1.3 细胞处理方法1.3.1 细胞处理方法为观察TG诱导的102细胞ERS及ERS

16、对细胞增殖活力、C-Me1的影响，将102细胞按10个/孔接种于6孔板，融合度达60%以上时，加1mTG干预12h、24h、48h后，收集样品，行Westernb1ot观察ERS标志物和C-Met蛋白的变化。1.2 2细胞处理方法二为观察SaIUbrina1预干预时TG诱导的ERS及细胞增殖活力、C-Met的影响，将102细胞按照IO5个/孔接种于6孔板，分为两组，即TG组和SaIUbrinaI+TG组。待细胞生长融合度为70%8()%时,加2()MSa1ubrina1预干预2h,随后加入TG诱导ERS48h,之后行Westernbkn检测ERS相关标志物和C-Met蛋白的变化。1.4 实验方法1.4.1 CCK-8比色法测定细胞增殖取对数期102细胞，按Ix1O5