人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠神经内分泌免疫网络的调节机制研究.docx

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1、人参与蛤蛤配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠神经内分泌免疫网络的调节机制研究周蓿朱巧凤陈誉丹冯莉婷刘舒凌吴燕春关键词人参；蛤妹；配伍；肾阳虚；下丘脑-垂体-肾上腺轴；下丘脑-垂体-甲状腺轴；下丘脑-垂体-性腺轴；神经内分泌免疫网络人参为五加科植物人参PanaxginsengC. A. Mey.的根和根茎，性微温,味甘、微苦，主归脾、肺、心、肾经，临床常用于治疗久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等1。因其具有强心、免疫增强、抗衰老、抗肿瘤等广泛的药理作用，故具有极高的药用价值2。蛤蛤为壁虎科动物蛤妹GekkogeckoLinnaeus.的干燥体，性平而味咸,主归肺、肾经，临床常用于治疗虚喘气促、阳痿、遗精等

2、1。本草纲目日：“昔人言补可去弱，人参、羊肉之属。蛤蛤补肺气，定喘止渴，功同人参;益阴血，助精扶羸，功同羊肉”。经典人参蛤蚣补虚药对配伍出自卫生宝鉴“人参蛤蛇散”、医级“人参蛤蛤丸”、圣济总录“独圣饼”等，临床应用历史悠久。古今诸多医家认为蛤蛤配伍人参使用可增强补虚壮阳之效。目前的研究多集中在人参、蛤蛤为君药的复方治疗喘息性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等肺系疾病3-5。本课题组前期研究已明确蛤蚣对肿瘤、衰老等均具有实验免疫调节作用，并对肾阳虚动物具有改善作用6-8,但蛤蛤配伍人参后，是否能增强其补肾阳作用及相关机制尚未明确。中药配方颗粒由于质量标准统一，更有利于进行配伍的药效学研究。

3、目前中药配方颗粒的药理作用研究主要集中在抗炎、止痛等中医药优势领域9。本研究通过氢化可的松复制肾阳虚模型大鼠，观察人参与蛤蛤配方颗粒配伍应用对模型大鼠的补肾阳作用，并探讨其对模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal, HPA）轴、下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamuspituitary-thyroid, HPT）轴、下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG）轴及免疫功能形成的神经内分泌免疫网络的调节机制，为人参与蛤蛤配方颗粒的临床配伍应用提供科学依据。1材料SQP型精密电子天平购自赛多利斯

4、科学仪器（北京）有限公司；InfiniteM200Pro型酶标仪购自瑞士 Tecan公司；i2000型全自动免疫发光分析仪购自美国Abbott公司；cobas?c311型全自动生化分析仪购自德国罗氏诊断有限公司；TGL-16型低温离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；GeneAmpPCRSystem9700型基因扩增仪、ViiATM7型实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）系统均购自美国ABI公司;BX43型光学显微镜购自奥林巴斯贸易（上海）有限公司。1.2主要药物与试剂人参配方颗粒购自江阴天江药业有限公司（批号20220253,每2.50g颗粒相当于饮片10g）；蛤妹配方颗粒购自深

5、圳华润三九医药股份有限公司（批号1903001C,每2.99g颗粒相当于饮片20g）;金匮肾气丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂（批号1803280,规格360丸）；氢化可的松注射液购自百正药业股份有限公司（批号1908003 , 规格 10mg ： 2mL ); 环磷酸腺甘cAMP ）、环磷酸鸟普(serumeye1icadenosinemonophosphate ,(guanosinecyclicphosphate,cGMP）.促肾上腺皮质激素释放激素(corti cot r op i nr e 1 eas i nghormone , CRH )、促肾上腺皮质激素(adrenoco

6、rticotropichormone, ACTH)、皮质醇(cortisol, CORT)睾酮（testosterone , T ）的大鼠酶联免疫吸附测定（enzyme-1 inkedimmunosorbentassay, ELISA）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号分别为LY2B9CTRRR.6P6TK8JK57. N3VIFVDNRX. 3H9J32UP8h 512AVRZZQT. 9DVDF6-2B98)；三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine, T3）、甲状腺素（thyroxine,T4）、雌二醇（estradiol, E2）的放射免疫分析试剂盒均购自意大

7、利DiaSorin 公司（批号分别为 202246、202213B. RE34872）；鼠源 IgG、IgM试剂盒均购自德国罗氏诊断有限公司（批号分别为38451501.35257501 ）5Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司（批号 15596026）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号G1120） ；GoldView染料购自上海赛百胜基因技术有限公司（批号HGV-II ） ；RNA酶抑制剂、SuperScriptTMI反转录酶购自美国Epicentre 公司（批号分别为 SRI6310K.RF910100）；2PCRMasterMix核酸扩增试

8、剂购自美国Arraystar公司（批号AS-MR-006-25）。L3动物48只雄性SPF级SD大鼠，体质量（20020） g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK （湘）2022-0002o本研究经广西中医药大学伦理委员会审核通遇（批准号DW20220226-003）o2方法2.1分组、造模与给药大鼠适应性喂养1周，根据体质量按随机数字表法分为正常组、模型组、金匮肾气丸组（阳性对照）、人参组、蛤蛇组、配伍组，每组8只。除正常组外，其余组大鼠每天后腿肌内注射氢化可的松25mgkg,连续15d进行造模，根据参考文献10判断造模是否成功；正常组同期肌内注射等体积生理盐水。造模

9、成功后，对各组大鼠进行灌胃。金匮肾气丸组灌胃剂量为2.33gkg,临用时用生理盐水配制。人参、蛤蛤按照配方颗粒量/饮片量比例、人体质量60kg换算，并参照人与大鼠体表面积折算的等效剂量比值换算,临用时用生理盐水溶解,37七水浴搅拌5min,配制混悬液。人参组灌胃剂量为0. 53gkg （临床等效剂量的2倍），蛤蛤组灌胃剂量为0.21gkg （临床等效剂量的2倍），配伍组灌胃剂量为人参配方颗粒0. 53gkg和蛤蛤配方颗粒021gkg。模型组和正常组灌胃等体积生理盐水。所有大鼠灌胃体积均为 10Lkg，每日1 次，共灌胃 28d。69ECAE9E-C3DB-4533-8629-989038415

10、B822. 2大鼠体质量、肛温测定分别于灌胃前和灌胃第7、14、21、28天，采用电子天平测定大鼠体质量，采用电子体温计测定大鼠肛温。2. 3取材与处理灌胃28d后，大鼠禁食不禁水12h,然后以水合氯醛麻醉取血。血样以3000rmin于4离心10min,取上清液于-80保存。腹主动脉取血后，在冰上将大鼠左右肾上腺、甲状腺、左右睾丸完整剪下，生理盐水洗净，置于4%甲醛溶液中固定。在冰下摘取大鼠下丘脑，置于冻存管在-8（C保存待测。2. 4大鼠血清cAMP. cGMP水平检测采用ELISA法检测。根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。按相应试剂盒说明书方法检测大鼠血清c

11、AMP、cGMP水平并计算cAMPcGMPo2.5 大鼠 HPA 轴（CRH、ACTH、CORT）、HPT 轴（T3、T4）、HPG轴（T、E2）、免疫（IgG. IgM）相关指标检测根操“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。采用ELISA法，按相应试剂盒说明书检测大鼠血清CRH、ACTH、CORT、T水平。采用放射免疫法，按相应试剂盒说明书检测T3、T4、E2水平。采用免疫比浊法，按相应试剂盒说明书检测IgG、IgM水平。根据检测结果计算T/E2。2 . 6大鼠肾上腺、甲状腺、睾丸组织病理形态学观察根据2.1项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。肾上腺、

12、甲状腺、睾丸组织用4%甲醛溶液固定，再进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、乙醇梯度脱蜡、HE染色，采用光学显微镜观察组织病理形态学变化并拍照。3 .7大鼠下丘脑CRH、TRH、GnRHmRNA表达水平检测采用qRT-PCR法检测。根据“2. 1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。取-8（TC冻存的下丘脑（每组取3只小鼠样本），先用Trizol提取总RNA,反转录成cDNA后行PCR扩增,用以检测CRH、促甲状腺激素释放激素（thyrotropinreleasinghormone, TRH）、促性腺激素释放激素（gonadotropin-re 1 eas inghor

13、mone, GnRh） mRNA表达水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及产物长度见表lo2. 8统计学分析采用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料以xs表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准 =0. 05 o3结果2.1 人参与蛤蚣配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠体质量、肛温的影响与正常组比较，模型组大鼠体质量在不同时点均显著降低（P0.05）；灌胃第7、14、21、28天，各给药组大鼠体质量均有升高趋势，但差异无统计学意义(P0.05)。与配伍组比较，人参组、蛤蛤组大鼠体质量在不同时点的差异均无统计学意义(P0.05)结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠肛温在各时点均显著下降(P0. 05)o与模型组比较，配伍组大鼠肛温在灌胃第7、14、21、28天均显著升高(P0. 05)o结果见表4。3. 3人参与蛤蚣配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠HPA轴、HPT轴、HPG轴、免疫相关指标的影响与正常组比较，模型组大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4、T水平和T/E2均显著降低，E2、IgG、IgG水平均显著升高(P0. 05),金匮肾气丸组T4水平显著升高(P