链霉素发酵工艺验证关键步骤.docx

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1、链霉素发酵工艺验证方案1. 目时确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备的发酵液能否到达中间体规格规定。2. 范围：此方案包括一种50吨大罐链霉素发酵液的（生产过程。2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原斜面2.2.2代一代2斜面2.2.3母瓶2.2.4子瓶2.2.5小小罐2.2.6小罐2.2.7中罐2. 2.8大罐2.3验证环节：确定验证方案，确定验证计划，内容、环节，以便精确验证链霉素发酵系统。3. 验证措施概要：3. 1生产记录：原斜面：冷藏期W1O天外观无菌外观集落：白色丰

2、满、正常代I或代2斜面：冷藏期W14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时21700um1效价96小时23500um1效价120小时N6700um1冷藏期W5天菌龄5064小时菌丝II-III子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时N7000um1效价144小时27500um1冷藏期W7天菌龄30-44小时小小罐：菌丝II-III镜检无菌放罐效价2800um1,残CW3.5g100m1,残N140mg/IoOm1PH7.5小罐：菌丝nIII镜检无菌放罐效价21200um1,残C3.5gIOOm1残NW

3、140mg/IOOm1PH7.5中罐：菌丝IIIII镜检无菌放罐效价21800um1,残C3.5gIoomI,残NW140mg/IOom1,PH7.5大罐：放罐残糖2.0克/100毫升放罐残氮W120毫克/100毫升放罐透光度240%放罐效价214000um13.2 原材料：生产过程中所用的多种原材料及其规格(见原材料一览表)3.3 设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。3.4 以上所及设备的每一部分，必须在本次验证前保证通过合适鉴定(IQ/OQ),并且任何有关的测试装置通过校正。3.5 人员培训，作为验证研究日勺一部分，波及生产链霉素发酵的每位职工均经GMP及有关岗位SOP培训。4. 生产程

4、序和流程表：4.2 生产过程的描述：4.2.1 我厂用于生物合成链霉素日勺生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种日勺生命活力和稳定性，将他子保留于干燥的沙土内冷藏在24C冰库内，或者将抱子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于196C液氮中。每年对生产菌株进行两次自然分离，控制菌落变异率5%,并进行菌丝八代遗传稳定性考察，考察其母、子代谢及效价单位的稳定性。挖取清洁海滩细沙（不能污染多种有机物），用自来水漂洗清洁，洗至漂出来的水澄清不浑浊为止，烘干、100目筛子过筛，用磁铁充足吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土（不能污染多种有机物），用自来水充足漂洗消毒，洗至漂出来的水澄清为止，烘干，120目筛子过

5、筛,用磁铁充足吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装于玻璃试管（12X10Omm）,每支装1g,用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MPa,温度122,时间1小时，消毒后置电烘箱烘干，110120、45小时，外表明批号、日期备用，使用前为保证无菌起见，应按以上规定再消毒烘干一次。取符合质量规定的胞子斜面一支，在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水Im1左右，用1#棒将表面抱子轻轻刮下（防止用力过重划破琼脂）摇匀，用ImI割头无菌吸管吸出，精确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1m1抱子液（加入时应注意将吸管伸至靠近沙土处

6、，但又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁）。塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空干燥器内（干燥器内放置氯化钙干燥剂）保持真空度S1OMPa,抽4支时维持抽干4小时，抽5支或以上时，抽干时间酌情增长，取出抽干的沙土抱子，敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封，放24冰库中保留备用。使用时采用干接法接种。抱子沙土管有效有效期为2年。市售新鲜牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115C117C,0.07MPa,1520分钟消毒。将空白安培管洗净烘干，塞好棉花，置于消毒锅内121C,60分钟，间隙灭菌三次，待用。取符合质量规定的抱子斜面一支，加入无菌脱脂牛

7、奶5IOm1,用2#棒轻轻将抱子刮下，用无菌吸管吸抱子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，振摇10分钟,然后用Im1无菌吸管将珠子瓶内的抱子牛奶悬浊液加入无菌安培管中，0.3m1支，做好标识存置于液氮中保留，寄存有效期5年。4.2.2 种子组洁净工作台洁净等级100级，每三个月对尘埃粒子（20.5u时尘埃W3.5粒/11空气）、风速（20.35m/s）、无菌（定点启动双碟30分钟WI个/碟）进行测定。平时每次操作定点放置定点启动双碟30分钟，控制杂菌菌落W1个/碟。每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消毒剂（1/600洁尔灭、75%酒精）。4.2.3 抱子斜面：取生产用之抱子沙土管或抱子冷冻管在无菌室内

8、，用操作棒勺取适量抱子接种于斜面培养基上，尽量将狗子涂开使长单个集落，然后于27士恒温室内培养6-7天，该生长成之抱子斜面称为原斜面，仅作胞子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻泡子接出原斜面。根据质量状况可酌量考虑制作母瓶，有效有效期在24C冷藏中不超过10天。斜面外观除了个别不正常集落以外，应大部份为白色，丰满梅花型，馒头型、圆型之集落，将原斜面抱子，挑选23只正常集落点种第一代，用第一代传代斜面同样点种第二代传代斜面，第一第二代他子斜面，培养条件均为271C恒温室内培养67天，第一、第二代斜面有效有效期为14天，均可制作母瓶，狗子斜面传到第二代为止，不再传第三代，挖块制作过母瓶之剩余抱子斜面

9、，应保留在冷藏库中一种月，以备检用。斜面培养基配制法:名称配比%葡萄糖（注射用）0.81.2蛋白陈0.30.6氯化钠0.40.6豌豆浸出液1216琼脂（海燕牌）2.02.8PH7.07.4消后规格:C(g100m1)N(mg100m1)32-38P(ugm1)60-90PH豌豆浸出液制备：豌豆：30克氯仿：0.5%（二次）自来水：加至IOOOm1IMH2SO4:调PH用将30克豌豆洗净沥干，加入IOOOm1自来水，用IMH2SO4,调PH至4.24.5,力口0.5%氯仿、盖上磨砂瓶塞，振荡摇匀后，放出气体，再盖紧放置于37恒温室一昼夜取出，再用1MH2SO4调整PH值维持在4.24.5,力口0

10、.5%氯仿摇匀、盖紧放371恒温室6天，粗滤除去豌豆，滤液分盛于开口的搪瓷杯中，置沸水浴中，煮沸20分钟（清除氯仿）冷却，用滤纸过滤，清除沉淀的蛋白质、分装于750m1摇瓶中，每瓶装量约20OmI左右，以0.09Mpa、118120CB条件消毒20分钟，冷却后放入冰箱中备用。同步抽样送化验，检查质量，在使用该批豌豆浸出液时，必须再送一次样品，测定氨氮含量与第一次相靠近时可按后一次样含量计算使用，如第二次含量与第一次不符，须再抽样复试，以最终一次化验数据为准进行计算使用。豌豆浸出液质量:项目规格外观澄清液氨氮(NH2-N)170-200mg100m1磷（PO4）600ug100m1左右无菌状况无

11、杂菌4.2.4 母瓶：用符合质量原则的同支抱子斜面（冷藏期不超过14天）在无菌室内用挖块法分别将抱子接种到已准备好之二只摇瓶中，编号为母I母II,接种后送至温度271C恒温摇瓶间内，在23020r/mm摇瓶机上,培养5064小时，菌丝阶段II一IH初之母I用牛皮纸包扎寄存于24。C冷库中，母继续培养作质量检查，做无菌试验二支，分别进行27C及37C培养。68小时取样分别测定单位粘度，氨氮消耗、PH、u/m1,后来每24小时取一次样测定上述项目,合计三次（68小时，96小时，120小时三次）如母瓶质量符合规定，则母瓶可以进罐使用，母瓶有效冷藏期为5天。制得的母瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒、米黄

12、色、无异味不化稀无菌正常。效价：120小时26700um1接子瓶的母瓶制备法，用无菌操作挖一块斜面，接入一只母瓶，在摇瓶机上培养5064小时，取下，挑选外观正常菌丝粘稠，色泽米黄，无颗粒状菌丝日勺母瓶，作为接子瓶用，接种子瓶的I母瓶不冷藏。遇特殊状况，一般冷藏不超过5天。母瓶原材料及配例如下：原材料配比葡萄糖3.55.5黄豆饼粉3.04.5碳酸钙0.50.8硫酸镂0.50.8氯化钠0.25-0.5磷酸二氢钾0.04-0.07消后质量规格:C(gm1)3.84.8N(mg100m1)130155P(ug100m1)130155取符合种子质量原则之母瓶，在无菌操作条件下，用吸管接入已准备好的子瓶培

13、养基中，每瓶接种量约3m1,瓶数按需而定（母瓶接子瓶前做无菌试验斜面二支，分别培养于27,37恒温室，母瓶接子瓶后,吸管做无菌试验斜面一支，在37C恒温室培养），接种后子瓶送271C恒温室培养3044小时，菌丝阶段在III初，长好后，留五瓶继续培养，作质量分析，其中三瓶在120及144小时分别取样测定效价，一瓶测粘度及氨氮，一瓶接无菌斜面二支作无菌试验（分别培养于27,37C恒温室）及观测菌丝形态，（新菌株要加测C及PH）其他瓶冷藏于24冰库中备用有效冷藏期为7天，如在保留期间发既有化稀现象或有染菌嫌疑，即停止使用，改用其他批号种子，放摇瓶种子应同步准备有23批瓶存备用。制得的子瓶应菌丝稠粘，

14、目检无菌丝团颗粒，米黄色，无异味。不化稀（比母瓶厚）。效价：120小时N7000um1,144小时27500umh子瓶原材料及配例如下：原材料配比葡萄糖3.55.5黄豆饼粉2.3-3.5碳酸钙0.20.7硫酸核0.5-0.7氯化钠0-0.2磷酸二氢钾0.045-0.07豆油I1玉米浆0-0.2消后质量规格:C(gm1)6.0-4.8N(mg100m1)160-180P(ug100m1)1551804.2.5 小小罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫日勺更换检查严密度，检查部分包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌罐则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有

15、无培养基倒流。培养基实行实消：空消时预热至压力到达0.160.19MPa0排出罐内冷凝水后计空消时间为1545分钟，温度为125130C,空消时间到后压力跌OMPa进行投料实消。先加水至搅拌处，然后投入已配好的培养基，搅拌成匀浆状加热，打开各支路蒸汽，关闭罐盖待压力上升至0.07-0.12MPa时计时20分钟左右，消毒温度为115124C,结束后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH0小小罐采用摇瓶2-8瓶火焰接种，加空气流量至OJm3/分,5小时流量加至0.5m3分，一只小小罐种子可移入23只小罐作种子用。接后开始每4小时取无菌样，每8小时测PH和菌丝浓放罐测C和效价，25小时左右始每8小时测N,种子罐