冻融工艺在mRNA疫苗中应用.docx

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1、我国mRNA疫苗的商业化进程更慢，但已有多家企业入局。复星医药从BiONTeCh引进的复必泰虽然国外已上市，但在国内的上市进程却很缓慢。尽管如此，2023年复必泰在港澳台地区的销售额也超过了10亿元。表1.国内mRNA疫苗研发进展企业名称药物名称开发阶段复星医药/BioNTecBPfizerTbzinameran国外上市，国内I1期临床军科院/艾博生物/沃森生物ARCoVax川期临床复星医药/BioNTech/PfiZe1rAbdavomeran国外II/III期，国内I期临床丽凡达生物（艾美疫苗）1VRNA009I1期临床斯微生物DF104B1I1期临床云顶新耀（引进自Providence）

2、PTX-COVID19-BI1期临床锐博生物/阿格纳生物新冠mRNA疫苗I期临床康希诺生物新冠mRNA疫苗获批临床石药集团SYS6006获批临床虽然mRNA药物具有相当大的应用前景，但整个产业仍处于起步阶段，mRNA的序列设计和优化、mRNA的不稳定性、安全有效的体内递送仍然是mRNA疫苗开发和应用的重要挑战。O1mRNA疫苗生产工艺流程mRNA疫苗生产主要分为质粒DNA生产、mRNA原液生产和mRNA制剂生产三个环节。整个工艺的核心和基础是质粒DNA转录模板的序列设计，目前主流采用E.co1i作为工程菌，通过发酵培养来实现DNA扩增。因此，质粒DNA生产的主要工艺为：E.co1i菌种库复苏d

3、发酵扩增培养今收获裂解力澄清过滤今超滤浓缩今层析纯化力浓缩换液介质粒DNA线性化今超滤纯化切除菌过滤力分装冻存。虽然质粒DNA生产所用工艺技术为行业现有技术，但当前质粒DNA生产成本仍然较高，这一方面是由于质粒表达水平不高，只有3001000mg1,另一方面是由于质粒DNA为胞内产物并mRNA制备需要线性化的、特定长度且高纯度的质粒原料，这使得下游纯化路线较长，收率只有3040%。mRNA原液生产以线性化质粒DNA为转录模板，通过酶促多聚反应合成mRNA分子，属于无细胞体系的生物合成，因此相比于传统微生物或细胞培养反应，具有工艺过程简单、反应时间短、纯化收率高、生产成本低等优势。mRNA制备的

4、主要工艺为：体外转录力转录后化学修饰力DNA酶处理今层析纯化力超滤浓缩换液力原液除菌过滤今分装冻存。mRNA的纯度对于其安全性和有效性非常重要，因为杂质含量会影响到mRNA的翻译效率和免疫原性。另外，由于mRNA的稳定性较低，冷冻保存过程也可能导致新的杂质产生。mRNA最终制剂的生产是当前挑战最大的环节，主要在于递送系统的选择、工艺控制、供应链和专利限制等。mRNA原液的复融可能是被忽略的工艺环节，但复融过程中的重结晶可能是导致mRNA失活的重要原因之一。当前在研的递送载体包括脂质类、聚合物类等，但主流仍然是纳米脂质颗粒（1NP）o将mRNA用1NP包封的方法也很多，当前的主流是采用微流控技术

5、，通过高速的两相混合形成包封复合物。mRNA-1NP包封后经过越滤纯化、除菌过滤、无菌灌装和包装，即成为最终mRNA疫苗制品。超低温冷冻保存和运输也是当前mRNA疫苗应用的挑战之DownstreamSeparationProcessDownstreamPurificationProcess02WHO关于mRNA冻融稳定性的监管考虑为了给全球mRNA疫苗，尤其是新冠疫苗的生产和质控、非临床和临床评价等提供信息和法规监管指导，WHO于2023年10月正式通过了指南文件“Eva1uationofthequa1ity,safetyandefficacyofmessengerRNAvaccinesfor

6、thepreventionofinfectiousdiseases:regu1atoryconsiderations0指南在6.8.2节指出“应特别注意尽可能减少mRNA在包封过程中以及在生产条件下的降解，尤其是那些已知的会影响1NPs和最终mRNA-1NP疫苗产品稳定性的因素（比如，mRNA的复融，1NPS或mRNA-1NPs的冷冻速率）。指南在第6.8.4.5节指出mRNA在1NP的包封率应作为关键质量属性之一，因为未包封的mRNA是不稳定的。应确认最终产品的结构不会因为冻融循环和稀释而改变。03已上市COVID-19mRNA疫苗冻融案例分析具体现有mRNA疫苗的厂家都在哪些环节对冻融进行

7、了研究？以下分析内容节选自EMA公布的某COVID-19mRNA疫苗上市申请评估报告。InRNA表征申请人提供了mRNA活性物质的详细表征，包括mRNACX-024414结构特性的详细信息。此外，还提供了色谱图、热变性和冻融降解及其对蛋白表达的影响数据。评：该企业向监管机构提供了冻融降解的数据，以及冻融对蛋白表达的影响数据。生产工艺开发 mRNA-1oaded1NPintermediatemRNA-1NP复合物中间体提供了全面的开发数据，描述了在开发过程中所做的变更，包括规模放大、增加原液冷冻步骤、一些设备变更和脂质摩尔比调整以匹配平台工艺。评：该企业在生产工艺开发过程中，增加了工艺放大过程，

8、原液生产出来后，增加原液冷冻步骤，确保工艺的一致性。产品生产和工艺控制1NP生产工艺包括脂质原料溶液（1SS）制备、纳米沉淀混合、切向流过滤（TFF）,稀释和冷冻保护剂添加、澄清、灌装以及冷冻和储存。评：在生产工艺中冷冻和存储是分开的，产品经冷冻后存储。工艺步骤必须关注批次间和批次内的均一性，冷冻速率是关键参数之一。产品稳定性 mRNA-1oaded1NPintermediate装载mRNA的1NP中间体使用开发批次进行了支持装载RNA的1NP中间体冻融循环的稳定性研究。结果表明，mRNA-12731NP生物物理属性（粒径、多分散性、封装）不会受到不同冻融过程（室温或28。C）或5个冻融循环的

9、影响。成品还进行了支持成品冻融循环的稳定性研究。冻融循环重复了多达五次。所有结果都在标准范围内，表明最终产品在反复冻融中相对稳定，支持五次冻融循环。然而，批准上市的产品信息中显示，成品不允许反复冻融。评：采用经优化的冻融工艺，中间体和成品可以耐受反复冻融，使产品质量不受冻融循环的影响。临床研究的设计和执行RT-PCR分析经过了可接受的验证，并提供了额外的验证研究，以评估临床样品在各种温度和冷冻/复融循环中的稳定性，以涵盖运输和储存条件。评：在临床阶段做的冻融稳定性实验，涵盖运输和存储，也说明冻融实验的关键。为后期上市做准备。04SUS的冻融工艺方案和建议该企业采用了什么样的冻融生产工艺方案？该

10、公司在冻融工艺的开发过程中，和SUS进行了紧密的合作。SUS根据此公司的特定工艺要求，开发相应的冻融曲线和工艺方案。JupE7004up22201）Mpto3201）可放大的冻融工艺平台如何降低冻融过程对InRNA产品稳定性的影响？冻融过程从多个方面对mRNA分子形成压力，工艺优化的目标是减少这些压力的影响，包括： 尽可能减少冷冻浓缩带来的浓度影响。 尽量减少PH漂移给mRNA分子带来聚集的发现 减少mRNA与冰液界面相互作用不可控冷冻导致冷冻浓缩（左）和可控平板冻融实现均一冻结（右）怎样的冷冻工艺有利于InRNA产品质量？经验丰富的mRNA公司会选择尽可能快地冷冻mRNA,某公司要求在5小时

11、内从液体冷冻到-60。C0以下是SUS公司为该mRNA公司提供的工艺摸索条件:袋子形式HeightmmhBagSize(1)TargetFi11ingVo1umefi11.VFastestFeezingto-60(H)t105970109.64.5100852-26%107.6-21%3.25-28oC不同冷冻保护壳(1059&1008)和装量的冷冻数据FRCRoSS1008-preconditionedto90C曲线SUS提供怎样的冻融工艺解决方案？SUS公司专注于下游到灌装之间的解决方案，产品涵盖袋子保护壳RoSS,分装设备RoSS.Fi11、冻融设备RoSS.pFTU、运输箱体RoSS.

12、Ship等。SUS的产品特点： RoSS保护壳的专利技术，完美保护了袋子的安全； RoSS.Fi11快速精确分装，超高灵活性和安全性； RoSS.pFTU冻融设备大容量，超低温，完美的冻融曲线； RoSS.Ship超长的保温时间和超高安全的运输方式。现在RoSS.Fi11分装系统和冻融系统在全球已经超过200多个用户。研熠作为SUS在中国的合作伙伴，提供SUS产品的技术咨询、产品销售和技术服务等。总而言之mRNA是不太稳定的产品，在产品开发阶段、临床阶段，工艺放大阶段都需要对冻融展开充分研究，确保合适的配方，在后续放大生产需要根据之前积累的数据，进行可放大的冷冻和解冻，使之在整个生产工艺能按照之前开发的产品特性保持一致的同时，提供产品的得率。