超氧阴离子Oxygenfreeradical,OFR试剂盒说明书.docx

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1、超氧阴离子（OXygenfreeradica1,OFR）试剂盒说明书微法100T/56S注意,正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会时细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。测定原理：超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2,NO2在对氨基苯磺酸和a一蔡胺的作用下，生成红色的偶氮化合物,在53Onm处有特征吸收峰，根据A值可以计算样品中。2含量，反应式为NdOH+2Ch+HNO2+H2O2+H2Oo自备实验用品及仪器：天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色

2、皿/96孔板、氯仿和蒸储水。试剂组成和配制：提取液：液体IIom1X1瓶，4保存。试剂一：液体20m11瓶，4保存。试剂二：液体15m11瓶，4C避光保存。试剂三：液体15m11瓶，4避光保存。试剂四：氯仿，自备。超筑阴离子提取：1 .植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入Im1提取液）进行冰浴匀浆，然后，IOOOOg,4cC,离心20min,取上清置于冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为500:IooO：1的比例（建议500万细胞加入Im1提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒

3、，间隔7秒，总时间3min）:然后IOOOOg,4-C,离心20min,取上清置于冰上待测。3 .血清或培养液：直接测定。渊定操作表：分光光度计/胸标仪预热30min,调节波长至530nm.1、操作表空白管测定管样本（U1）200提取液（1）200试剂一（1）160160混匀，37水浴20min试剂二（1）120120试剂三（1）120120试剂四(1)200200混匀,8000g,25C,离心5min,小心吸取上层水相2001于微量石英比色皿白6孔板中，测定A530。A=A测定-A空白，空白管只要做一管。超筑阴离子含计算公式a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0242x-

4、0.0027,R2=0.99801 .组织：(1)按照样本质量计算超氧阴离子含量(nmo1/g鲜重)=(A+0.0027)00242V反总(V样V样总XW)X2=148.76(A+0.0027)W超氧阴离子产生速率(nmo1gmin)=148.76(A+0.0027)WT=7.44(A+0.0027)W(2)按照蛋白质浓度计算超氧阴离子含量(nmo1/mgprot)=(A+0.0027)+0.0242V反总(V样XCPIjX2=148.76(A+0.0027)Cpr超氧阴离子产生速率(nmo1/mgprotmin)=148.76(A+0.0027)CprT=7.44(A+0.0027)Cpr2

5、 .细菌，真菌：超氧阴离子含量(nmo1104ce11)=(A+0.0027)0.0242V反总(V样V样总X细胞数量)x2=148.76x(A+0.0027)细胞数量超氧阴离子产生速率(nmo1104ceHmin)=148.76x(A+0.0027)细胞数量T=7.44(A+0.0027)细胞数量3 .血清或培养液超氧阴离子含量(nmo1/m1)=(AA+00027)00242V反总V样2=148.76(A+0.27)超氧阴离子产生速率(nmo1m1min)=148.76(A+0.0027)T=7.44(A+0.0027)V样总：加入提取液体积，1m1：V反总：反应总体积，0.36m1：V样

6、：反应中样品体积，0.2m1；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样品质量，g：T：反应时间，20min：2:2分子。2参与反应生成1分子No2b.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0121x-0.0027,R2=0.99801 .组织：(1)按照样本质量计算超氧阴离子含量(nmo1/g鲜重)=(AA+0.0027)0.0121V反总(V样V样总XW)X2=297.52(A+0.0027)W超氧阴离子产生速率(nmo1gmin)=297.52(A+0.0027)WT=14.88(A+0.0027)W(2)按照蛋白质浓度计算超氧阴离子含量(nmo1/mgprot)=(A+0.00

7、27)+0.0121V反总(V样XCPrjX2超氧阴离子产生速率(nmo1/mgprotmin)297.52(A+O.OO27)CprT=14.88(A+0.0027)Cpr2 .细菌，真菌：超氧阴离子含量(nmo1104ce11)=(AA+00027)0.0121V反总(V样V样总X细胞数量)x2=297.52(AA+0.0027)细胞数量超氧阴离子产生速率(nmo1104ce11min)=29752(AA+00027)细胞数量T=14.88SA+0.0027户细胞数量3 .血清或培养液超氧阴离子含量(nmo1/m1)=(AA+00027)00121V反总V样2=297.52(A+0.0027)超氧阴离子产生速率(nmo1m1min)=297.52(A+0.0027)T=14.88(A+0.0027)V样总：加入提取液体积，1m1；V反总：反应总体积，0.36m1；V样：反应中样品体积，0.2m1；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样品质量，g：T：反应时间，2Omin；2：2分子。2一参与反应生成1分子NO2o注意事项：1、OD值大于1,样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。2、样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。