不同茶菌发酵液对病原细菌抑制作用的比较分析.docx

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1、不同茶菌发酵液对病原细菌抑制作用的比较分析红茶菌(kombucha),又称茶菌，是以糖茶水为原料，经由酵母、醋酸菌和乳酸菌组成的共生菌群发酵而成的传统发酵茶饮料口。用来发酵红茶菌的茶叶一般为红茶，大量文献报道也可以利用其他原料来替代红茶，如不同类型茶叶、水果、草药和香料等，开发出新型风味和功能的产品2-3。银杏是一种广泛分布在我国的药食同源植物，其叶片中化学物质种类繁多、含量丰富，活性成分如黄酮类化合物(166mgg)多达20几种，多类和总多酚含量分别占比0.42%和6. 89%,必需氨基酸含量约占总氨基酸含量的40%,维生素、微量元素和酚酸类含量占比也很高4。有研究发现银杏叶的主要提取物，如

2、多糖类、黄酮类化合物和银杏酚酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽泡杆菌有明显的抑制作用5-6。使用替代原料在发酵过程中不仅可以为茶菌的生长提供碳、氮源，其成分的生物转化也赋予茶菌不同的理化性质和更强的生物活性2-3。红茶菌发酵液能有效抑制革兰氏阴性和阳性细菌生长7,但对霉菌的抑制作用有限8。目前对茶菌发酵液的抑菌作用研究基本集中在对抗生素敏感性致病菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌和幽门螺杆菌等的敏感性菌株9,而对耐药菌的抑菌效果研究很少。病原菌的耐药性问题日趋严重，究其原因是抗菌药物的滥用，其中大肠杆菌与鲍曼不动杆菌传播广泛，极易对抗生素产生耐药性，在外界不断刺激下，亦可产生多重耐

3、药性10-11,如何有效抑制及感染后治疗是目前亟待解决的难题。本研究以红茶、绿茶和银杏叶3种材料制备茶菌发酵液，观察并检测发酵液的理化性质；采用琼脂扩散法和牛津杯法体外检测3种茶菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等病原细菌的敏感性菌株和大肠杆菌、鲍曼不动杆菌的多重耐药菌株的抑制效果；并选取铜绿假单胞杆菌和大肠T5bi株，探究不同发酵时间对银杏茶菌发酵液抑菌效果的影响。通过有益微生物的发酵作用提高茶叶和银杏的抑菌生理活性，发展对病原细菌(特别是耐药菌)具有抑制作用的功能微生物发酵产品。以期在大力倡导减少抗生素滥用的背景下，为新型食品防腐剂和抑菌药物的开发提供理论基础。1材料与方法L1

4、供试菌株和培养基红茶菌菌种、大肠杆菌(Escherichiacoli)01菌株、金黄色葡 萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽 袍杆菌(Baci1lussubtilis)铜绿假单胞杆(Pseudomonasaeruginosa)肺炎链球(Streptococcuspneumoniae) 、 座疮 丙(Propionibacteriumacnes),由福建师范大学生命科学学院微生物实验室提供；多重耐药性菌株大肠杆菌T5(耐氨羊青霉素、氯霉素、庆大霉素和妥布霉素)、大肠杆菌Pl-D6(耐氨羊青霉素、氯霉素和庆大霉素)和鲍曼不动杆(Acinetobacterbaumannii,

5、耐庆大霉素、妥布霉素、浏阳霉素、卡那霉素和氨羊青霉素)，由福建师范大学生命科学学院付新苗教授惠赠。所有菌株使用前暂存于-49冰箱。LB液体培养基(g/L)：胰蛋白脓10.0,酵母提取物5.0,氯化钠5.0,121灭菌30min LB固体培养基(g/L)：胰蛋白M 10.0,酵母提取物5.0,氯化钠10.0,琼脂20, 12UC灭菌30mino哥伦比亚血琼脂平板培养基购自成都彼样生物科技有限公司。红茶糖水培养液：红茶5g,白砂糖40g,蒸镭水800mL。绿茶糖水培养液：绿茶5g,白砂糖40g,蒸储水800mLo银杏茶糖水培养液(g/L)：银杏5g,白砂糖40g,蒸镭水800mL o1.2茶叶及试

6、剂红茶、绿茶、银杏叶，福建省福州市市场；氢氧化钠、酵母浸膏、琼脂等，国药化学试剂公司；细菌学蛋白陈，广东环凯微生物公司。1. 3供试菌培养挑取1环供试菌(芽抱杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌T5、01、P1-D6、座疮丙酸杆菌)在LB固体平板上划线，划线后平板置于379恒温培养箱培养24h,然后挑选大小适中的单菌落通过划线进行2次纯化培养。从纯化的平板上挑取菌体接种于50nLLB液体培养基内，置于摇床37,220rmin培养24h后，获得菌悬液。肺炎链球菌活化，挑取1环肺炎链球菌在哥伦比亚血琼脂平板上划线，划线平板置于37, 5%10%C02恒温培养箱培养24h,然后挑选单菌落通过划

7、线进行2次纯化培养。用移液枪吸取lL无菌水于纯化的平板上，并用接种环刮取菌体混于无菌水中，制备菌悬液。L4茶菌发酵及样品制备参照汪鹏辉等12的方法培养茶菌和制备发酵液样品。发酵液分别以红茶、绿茶、银杏为原料。首先用沸水将所用器具纱布等清洁杀菌，在800mL沸水中分别加入5g红茶、绿茶和银杏叶，待浸泡10min后用4层灭菌纱布过滤，在滤液中加入40g白砂糖，充分搅拌得到糖茶水。待糖茶水冷却至室温后，用ddH20补充至800mL。在无菌环境中加入200mL发酵710d的茶菌母液，混匀，并以4层灭菌纱布封口，在28T恒温培养箱中发酵7d,得到茶菌发酵液。茶菌发酵液经滤纸过滤去除发酵液中较大颗粒杂质后

8、，8000rmin离心5min,取上清液用孔径0. 22 m的滤膜过滤。收集滤液至100mL,经冻干处理48h后得到发酵液干粉，用lL无菌水稀释，存放于-20待用。1. 5茶菌发酵过程观察和理化指标测定茶菌发酵后，每天观察发酵液的变化，至发酵后7d记录发酵液中菌膜、发酵液浑浊度、风味的数据；测定发酵液0D值、pH值、酸度和还原糖含量12。1.6 抑菌试验采用牛津杯-琼脂扩散法检测不同茶菌样品的抑菌能力13。LB培养基于超净工作台中混匀倒平板并冷却至室温后，加入100 L供试菌悬浮液，涂布均匀。将灭菌后的牛津杯用无菌镶子固定在涂布有供试菌悬液的培养基平板上，每个平板中放置3个牛津杯。待牛津杯固定

9、后，向杯中加入200 L以上冻干后稀释的发酵液，置于37。下恒温培养24h。观察有无抑菌作用，测量并记录抑菌圈的大小。将100 UL肺炎链球菌悬浮液涂布于哥伦比亚血琼脂平板上,用直径为9mm的无菌打孔器在哥伦比亚血琼脂平板上打孔,每孔加入200uL发酵液样品，置于37七，5%10%C02恒温培养箱恒温培养24h后。观察抑菌圈的大小并做记录。将平板倒置于光线充足处，用游标卡尺“十”字法测量抑大小，并计算相对抑菌圈大小。相对抑菌圈大小计算如公式（1）所示:相对抑菌圈/mm=D-d式中：D,抑mm； d,打孔器直径,mmo1.7 发酵时间对茶菌抑菌作用的影响按以上银杏培养液的配方和培养方法,分别在发

10、酵后第5、9、13、17、21天取样，发酵液经过滤灭菌和冻干处理，编号后放置冰箱冻藏。按以上抑菌试验方法观察和测定不同发酵时间样品对铜绿假单胞杆菌和大肠杆菌T5菌株的抑制效果。1.8 数据处理及分析实验图像采用图像分析软件Adobelllustrator进行处理。实验数据采用数据分析软件GraphPadPrism6和0ringin8. 0进行统计分析和作图。所得的结果表示为平均值标准误差2结果与分析2. 1发酵液理化性质比较经多次预试验，红茶菌在银杏叶粉配制的糖水培养液中生长良好，培养514d,在培养液表面形成明显的菌膜。因此,进一步比较茶菌在不同原料配制的培养液中的表现。发酵7d后，观察和测

11、定红茶、绿茶、银杏发酵液的理化表现和数据如表1所示。在绿茶和红茶配制的茶糖水培养液中，菌体生长明显，发酵后第2天即可见培养液中不断产生细小气泡,发酵后第3天在培养液表面形成明显的菌膜。在银杏糖水培养液中，菌体生长较慢，气泡产生迟，数量也相对较少；菌膜的形成相比绿茶和红茶糖水培养液慢，菌膜薄。未溶解的银杏固形物易被絮状的膜吸附，使发酵液变澄清。银杏糖水经发酵后更加清亮，具有酸甜风味和清香。银杏糖水发酵液在色、香、味方面要优于红茶与绿茶，但银杏茶菌的生长较慢，培养周期略长。发酵7d后，红茶、绿茶和银杏发酵液的pH值分别为3. 08、2.83和2.75。表1发酵7d后3种茶菌发酵液理化性质比较Tab

12、lelComparisonofphysicochemicalpropertiesofthreedifferentkombuchateaafter7daysoffermentation2. 2茶菌发酵液对病原细菌的抑制作用以红茶为原料的茶菌发酵液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞和座疮丙酸杆菌的相对抑菌圈直径分别为4.5、4. 33.16. 7mm（表2,图1）,对座疮丙酸杆菌的抑制效果最为明显;对枯草芽抱杆菌、大肠杆菌01菌株、大肠杆菌T5和大肠杆菌P1-D6等菌株没有抑制效果。以绿茶为原料的茶菌发酵液对供试的铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等菌株均有抑制作用；其中，对铜绿假单胞杆菌的抑制效

13、果最为明显，抑菌圈直径达到23. 33,与其他菌株相比差异显著（P0. 05） o和红茶为原料的发酵液相比，以绿茶为原料的发酵液对大肠杆菌多重耐药菌株T5和P1-D6也有较强的抑制作用，相对抑菌圈直径达到18mm左右（表2）。表2茶菌发酵液对致病菌的抑制作用Table2InhibitoryeffectsofteafungusbrothongrowthofpathogenicbacteriaN=3）注：相同小写字母表示差异不显著（P0 05）,不同小写字母表示差异显著（P0. 05）（下同）A-红茶菌发酵液对铜绿假单胞菌的抑制作用；B-红茶菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制作用；C-红茶菌发酵液对大

14、肠杆菌T5菌株的抑制作用；D-绿茶菌发酵液对铜绿假单胞菌的抑制作用；E-绿茶菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制作用；F-绿茶菌发酵液对大肠杆菌T5菌株的抑制作用图1茶菌发酵液对病原菌的抑菌作用比较Fig. llnhibitoryeffectsofteafungusbrothongrowthofpathogenicbacteria2. 3银杏茶菌发酵液对病原细菌的抑制作用2. 3.1对敏感菌的抑制效果银杏茶菌发酵液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌和大肠杆菌01菌株等抗生素敏感菌株的相对抑菌圈大小分别为21. 67、12. 50. 2. 03. 4.33mm（图2）。银杏茶菌发酵液对3株肺

15、炎链球菌也有一定的抑制效果。对I型肺炎链球菌、型肺炎链球菌和m型肺炎链球菌的相对抑菌圈大小分别为 3. 67、9.83. 6. 50mm（图 2）。A-银杏茶菌发酵液对不同病原细菌抑菌圈大小比较；B-银杏茶菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用；C-银杏茶菌对型肺炎链球菌的抑制作用图2银杏茶菌发酵液对病原细菌的抑菌作用Fig. 2Inhibitoryeffectsofginkgokombuchabrothongrowthofpathogenicbacteria2. 3. 2对多重耐药菌的抑制效果银杏茶菌发酵液对多重耐药性菌株鲍曼不动杆菌、大肠杆菌T5和大肠杆菌P1-D6的相对抑菌圈大小分别为7. 83.13. 00、15. 33mm ( 2-A,图 3)。A-大肠杆菌T5菌株；B-大肠杆菌P1-D