乳酸菌食品中污染菌的计数和MALDI-TOF MS鉴定.docx

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1、的限量。然而，有些标准如GB107652022,基于菌落总数测定是在有氧条件下进行的，对添加了厌氧乳酸菌的产品，又规定了菌落总数的限量。这些标准的差异，对乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的计数造成了较大的困扰。一方面，食品安全国家标准对食品中添加的菌株是否为厌氧菌的判断,没有具体规定；另一方面，为保持双歧杆菌等厌氧菌的高活性并发挥益生功效，一些菌剂的生产厂商对双歧杆菌进行了耐氧驯化10,使得一些传统上认为是厌氧的乳酸菌，在有氧的条件下也能生长。因此，须从计数平板上排除乳酸菌的干扰，只是特异性针对非乳酸菌等污染菌进行计数。对计数琼脂上菌落的鉴定，以迅速准确区分乳酸菌与非乳酸,是乳酸菌食品中污染菌计数

2、的又一难点。采用传统的生物化学方法鉴定乳酸菌，操作繁琐且准确性低11；近来兴起的一些分子生物学方法检测乳酸菌，如PCR法、16SrDNArRNA基因序列分析法、变性梯度凝胶电泳法等等,但都要采用特定的引物或探针，针对特定菌进行检测，并不适合对未知菌的鉴定12T5,变性梯度凝胶电泳法等方法还要对PCR产物进行后处理16。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展起来的一种用于蛋白质、多肽等生物大分子鉴定的新技术，其原理是将待测菌与基质混合后,用激光轰击电离，根据到达检测器的时间及离子的数量，绘制横轴为质荷比mz,纵轴为峰强度值的图谱，与数据库中的限量。然而，有些标准如GB107652022,基

3、于菌落总数测定是在有氧条件下进行的，对添加了厌氧乳酸菌的产品，又规定了菌落总数的限量。这些标准的差异，对乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的计数造成了较大的困扰。一方面，食品安全国家标准对食品中添加的菌株是否为厌氧菌的判断,没有具体规定；另一方面，为保持双歧杆菌等厌氧菌的高活性并发挥益生功效，一些菌剂的生产厂商对双歧杆菌进行了耐氧驯化10,使得一些传统上认为是厌氧的乳酸菌，在有氧的条件下也能生长。因此，须从计数平板上排除乳酸菌的干扰，只是特异性针对非乳酸菌等污染菌进行计数。对计数琼脂上菌落的鉴定，以迅速准确区分乳酸菌与非乳酸,是乳酸菌食品中污染菌计数的又一难点。采用传统的生物化学方法鉴定乳酸菌，操作

4、繁琐且准确性低11；近来兴起的一些分子生物学方法检测乳酸菌，如PCR法、16SrDNArRNA基因序列分析法、变性梯度凝胶电泳法等等,但都要采用特定的引物或探针，针对特定菌进行检测，并不适合对未知菌的鉴定12T5,变性梯度凝胶电泳法等方法还要对PCR产物进行后处理16。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展起来的一种用于蛋白质、多肽等生物大分子鉴定的新技术，其原理是将待测菌与基质混合后,用激光轰击电离，根据到达检测器的时间及离子的数量，绘制横轴为质荷比mz,纵轴为峰强度值的图谱，与数据库中的限量。然而，有些标准如GB107652022,基于菌落总数测定是在有氧条件下进行的，对添加了厌氧乳

5、酸菌的产品，又规定了菌落总数的限量。这些标准的差异，对乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的计数造成了较大的困扰。一方面，食品安全国家标准对食品中添加的菌株是否为厌氧菌的判断,没有具体规定；另一方面，为保持双歧杆菌等厌氧菌的高活性并发挥益生功效，一些菌剂的生产厂商对双歧杆菌进行了耐氧驯化10,使得一些传统上认为是厌氧的乳酸菌，在有氧的条件下也能生长。因此，须从计数平板上排除乳酸菌的干扰，只是特异性针对非乳酸菌等污染菌进行计数。对计数琼脂上菌落的鉴定，以迅速准确区分乳酸菌与非乳酸,是乳酸菌食品中污染菌计数的又一难点。采用传统的生物化学方法鉴定乳酸菌，操作繁琐且准确性低11；近来兴起的一些分子生物学方法检

6、测乳酸菌，如PCR法、16SrDNArRNA基因序列分析法、变性梯度凝胶电泳法等等,但都要采用特定的引物或探针，针对特定菌进行检测，并不适合对未知菌的鉴定12T5,变性梯度凝胶电泳法等方法还要对PCR产物进行后处理16。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展起来的一种用于蛋白质、多肽等生物大分子鉴定的新技术，其原理是将待测菌与基质混合后,用激光轰击电离，根据到达检测器的时间及离子的数量，绘制横轴为质荷比mz,纵轴为峰强度值的图谱，与数据库中孔，立即加入lLCHCA基质液；同时挑取质控菌株大肠埃ATCC8739纯培养物涂布至质控孔，立即加入1ULCHCA基质液；干燥后，用VITEKMS进行

7、鉴定。2结果与分析2.1乳酸菌粉的计数结果及分析由表1数据可见,6种乳酸菌粉在MRS平板上生长良好,乳酸菌计数结果与其标称的数量一致。在有氧条件下培养的PCA和CASF平板上，未见菌落生长，表明这6种乳酸菌在PCA琼脂上不生长，菌粉也没有受到非乳酸菌的污染。表1乳酸菌粉的计数结果单位：CFU/gTablelEnumerationresultsoflacticacidbacteriainstarterpowders2. 2市售含乳酸菌食品的计数和鉴定结果及分析从表2可知，市售的10种固体饮料和2种发酵乳的乳酸计数结果均大于106CFUg,表明这些食品中乳酸菌含量符合相关标准GB71012022和

8、GB193022022的要求。而这些乳酸菌食品的PCA和CASF的计数和菌落鉴定结果大致有以下5种情况。表2市售乳酸菌食品的计数及鉴定结果单位：CFU/gTable2EnumerationandidentificationofcommercialfoodscontaininglacticacidbacteriaATCC8739纯培养物涂布至质控孔，立即加入1ULCHCA基质液；干燥后，用VITEKMS进行鉴定。2结果与分析2.1 乳酸菌粉的计数结果及分析由表1数据可见,6种乳酸菌粉在MRS平板上生长良好,乳酸菌计数结果与其标称的数量一致。在有氧条件下培养的PCA和CASF平板上，未见菌落生长，

9、表明这6种乳酸菌在PCA琼脂上不生长，菌粉也没有受到非乳酸菌的污染。表1乳酸菌粉的计数结果单位：CFU/gTablelEnumerationresultsoflacticacidbacteriainstarterpowders2. 2市售含乳酸菌食品的计数和鉴定结果及分析从表2可知，市售的10种固体饮料和2种发酵乳的乳酸计数结果均大于106CFUg,表明这些食品中乳酸菌含量符合相关标准GB71012022和GB193022022的要求。而这些乳酸菌食品的PCA和CASF的计数和菌落鉴定结果大致有以下5种情况。表2市售乳酸菌食品的计数及鉴定结果单位：CFU/gTable2Enumerationa

10、ndidentificationofcommercialfoodscontaininglacticacidbacteriaATCC8739纯培养物涂布至质控孔，立即加入1ULCHCA基质液；干燥后，用VITEKMS进行鉴定。2结果与分析2.1 乳酸菌粉的计数结果及分析由表1数据可见,6种乳酸菌粉在MRS平板上生长良好,乳酸菌计数结果与其标称的数量一致。在有氧条件下培养的PCA和CASF平板上，未见菌落生长，表明这6种乳酸菌在PCA琼脂上不生长，菌粉也没有受到非乳酸菌的污染。表1乳酸菌粉的计数结果单位：CFU/gTablelEnumerationresultsoflacticacidbacter

11、iainstarterpowders2. 2市售含乳酸菌食品的计数和鉴定结果及分析从表2可知，市售的10种固体饮料和2种发酵乳的乳酸计数结果均大于106CFUg,表明这些食品中乳酸菌含量符合相关标准GB71012022和GB193022022的要求。而这些乳酸菌食品的PCA和CASF的计数和菌落鉴定结果大致有以下5种情况。表2市售乳酸菌食品的计数及鉴定结果单位：CFU/gTable2Enumerationandidentificationofcommercialfoodscontaininglacticacidbacteria(1)PCA上既有较多细小的菌落，又有少量较大的菌落(图结果进行比对，并利用MALDI-TOFMS技术对未知菌的快速鉴定优势，对PCA和CASF平板上的菌落进行快速准确鉴定,达到迅速区分乳酸菌与非乳酸菌的目的。本文发现，采用CASF计数，结合MALDI-TOFMS鉴定技术，可迅速准确地对乳酸菌食品中污染菌进行计数和鉴定。