基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证.docx

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1、基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证马旭东1杨进2陈林2/吴波3李嘉产王威威Y梁国标I（1.遵义医科大学贵州遵义563000；2.成都大学附属医院；3.郸都区人民医院）摘要：目的：利用网络药理学、生物信息学，研究黄杨碱抑制肾癌的作用机制，并通过人肾癌细胞系786-O,CakiT进行体外实验验证相关预测结果。方法：首先从PharmMaPPer数据库检索黄杨碱（CVB-D）的作用靶点，DiSGeNET数据库获得肾癌疾病靶点，随后通过venny平台整合CVB-D治疗肾癌的潜在靶点，把潜在靶点导入String数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络（PPI）,然后将String数据导入Cy

2、toSCaPe中修饰，并用CytoHUbba插件进一步分析网络中的Hub基因，得到的Hub基因用TCGA数据库作表达差异及生存分析。此外再用CVB-D与肾癌的交叉靶点数据进行GO和KEGG富集分析，得到黄杨碱治疗肾癌的潜在靶点中的分子功能及相关作用信号通路等分析结果。最后采用CCK-8、克隆形成、观察细胞形态实验、WeSternb1ot实验验证CVB-D对肾癌的作用结果。结果：分析得到CVB-D潜在作用靶点136个，疾病作用靶点2085个，CVB-D治疗肾癌的预测作用靶点68个，核心靶点5个。靶点共涉及生物过程238种，细胞组成30种，分子功能59种，参与肿瘤、PI3K-AKT,前列腺癌等细胞

3、信号通路222条；CCK-8、克隆形成、细胞形态实验结果表明，与对照组相比，CVB-D能显著抑制肾癌细胞的活力与增殖能力，呈浓度依赖性；流式细胞凋亡分析表明CVB-D能促进肾癌细胞凋亡，从而抑制肾癌细胞；Westernb1ot实验表明CVB-D作用后细胞中EGFR、p-PI3K,p-AKT相对表达水平降低，呈浓度依赖性，与空白组相比存在统计学差异（P0.05）o结论：黄杨碱可能通过EGFR靶点和PI3K-AKT信号通路诱导人肾癌细胞凋亡，从而在肾细胞癌的治疗中发挥重要作用。关键词：网络药理学；生物信息学；黄杨碱；肾细胞癌；表皮生长因子受体；PI3K-AKT通路Exp1orationofthem

4、echanismandexperimenta1verificationoftheinhibitoryeffectofCyc1ovirobuxineDonrena1ce11carcinomace11sbasedonnetworkpharmaco1ogyMaXudong1,2,YangJin2,Chen1in成都大学附属医院攀登人才计划（编号：RCJH-01-04）；成都优秀卫技人才发展专项资金；成都市医学科研课题（）；成都大学临床医学院附属医院创新团队项目（CDFYCX202307）通信作者Te1:E-mai1:,WuBo3,1iJia1,2,WangWeiwei1,2,1iangGuobiao

5、1,（1.ZunyiMedica1University,Zunyi563006,China;2.Affi1iatedHospita1ofChengduUniversity;3.PiduDistrictPeop1e,sHospita15Chengdu）ABSTRACTObjective:TostudythemechanismofCyc1ovirobuxmeDinhibitingrena1carcinomawithnetworkpharmaco1ogyandbioinformatics,andverifyingthepredictedresu1tsthroughhumanrena1carcinom

6、ace111ines786-0,Caki-Iinvitro.Methods:First1y,retrievingthetherapeutictargetsofCVB-DfromPharmMapperdatabase,andtherena1cancertargetsfromDisGeNETdatabase.Thenintegratingthepotentia1targetsofCVB-Dforthetreatmentofrena1cancerthroughVennyp1atform,andconstructingtheprotein-proteininteractionnetwork（PPI）t

7、hroughStringCytoHubbap1ug-ininCytoScapewasusedtofurtherana1yzeHubgenesinthenetwork.Afterwards,ana1yzingtheexpressiondifferencesandsurviva1ofHubgenesbyTCGAdatabase.Furthermore,thedataofthepotentia1targetsofCVB-Dforthetreatmentofrena1cancerwereana1yzedbyGOandKEGGenrichmentana1ysis,andthemo1ecu1arfunct

8、ionsandre1atedsigna1ingpathwaysofpotentia1targetsforthetreatmentofrena1cancerbyCVB-Dwereobtained.Fina11y,cck-8,C1onogenesis,ce11morpho1ogyandwesternb1otwereusedtoverifytheeffectofCVB-Donrena1carcinoma.Resu1ts:136potentia1targetsofCVB-D,2085diseasetargets,68predictivetargetsofCVB-Dinthetreatmentofren

9、a1cancer,and5coretargetswererecognizedafterana1ysis.Targetsarere1atedto238kindsofbio1ogica1processes,30kindsofce11compositions,59kindsofmo1ecu1arfunctions,andparticipatedin222ce11signa1ingpathwayssuchastumor,PI3K-Akt,prostatecancerandsoon.Comparedwiththecontro1group,CVB-Dcansignificant1yinhibitthevi

10、abi1ityandpro1iferationofrena1carcinomace11sinaconcentration-dependentmanner.F1owcytometryana1ysisshowedthatCVB-Dcou1dpromotetheapoptosisofrena1carcinomace11sandinhibittherena1carcinomamb1otexperimentshowedthatthere1ativeexpression1eve1ofEGFR、p-PI3Ksp-AKTince11streatedwithCVB-Ddecreasedinaconcentrat

11、iondependentmanner,whichwasstatistica11ydifferentfromthatintheb1ankgroup(P0.4)o通过CytoSCaPe7.2)调整并作图，再使用CytoHubba插件进一步分析网络中的Hub基因。1. 1.4富集分析使用基因本体论(GO)分析和京都百科全书(KEGG)通路富集分析用来探索生物学途径和潜在的功能。将交集靶点基因分别输入到DAVID数据库。和KEGG数据库O,限定物种为人，设置PVO.05,分析主要的生物过程和代谢途径，并进行富集分析，保存结果，并使用微生信O在线工具将数据可视化。1.1. 5核心靶点基因生物信息学分析从癌症基因组图谱(TCGA)数据集()获得肾透明细胞癌的RNAseq数据(IeVe和相应的临床信息。GTEX数据来自V8版本O。使用R软件v4.0.3进行统计分析。P值0.05被认为具有统计学意义。并利用基因表达分析交互分析数据集(GEP1A,)进一步