混菌发酵制备茶籽多肽及其抗氧化作用.docx

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1、菌丝1块，打散后接入PDA培养基中，28, 160rmin的条件下振荡培养72h,作为种子液。解淀粉芽泡杆菌种子培养：从保存的菌种斜面挑取1环PI142接至含30mLLB培养基的250mL锥形瓶中，28、200rmin振荡培养12h,作为PH42种子液。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UI

2、M-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至6

3、0目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬

4、坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽

5、多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250m

6、L) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选

7、取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量

8、、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗

9、分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。1. 3. 2混菌两段

10、发酵工艺流程混菌两段发酵工艺流程如下：茶籽预处理(干燥、脱壳、粉碎至60目)一发酵培养基调配(主料茶籽、辅料葡萄糖)一接种UIM-281(装液量100mL250mL) I段发酵一接种P42f 段发酵f离心(10000rmin, 10min)一取上清液、粗分离一茶籽多肽1. 3. 3混菌发醉培养条件主效应因子筛选基于前期UIM-281. PI142单因素发酵试验结果，设计Plackett-Burman试验对影响茶籽多肽产量的众多因素进行显著性筛选。入选的因素为：主料茶籽粉、辅料葡萄糖、UIM-281接种量、初始pH、I段发酵温度、I段发酵时间、PI142接种量、II段发酵温度、段发酵时间、摇床转

11、速。每个因素取高(+1)、低(T)两水平。基于PB试验结果，设计最陡爬坡实验，对主效应因子进行水平寻优。1.3.4响应面优化试验根据PB试验和最陡爬坡试验结果，选取主效应因子为自变量，以多肽产量为响应值，设计三因素三水平响应面试验。2. 4茶籽多肽的抗氧化活性2. 4. 1ABTS阳离子自由基清除活性未发酵茶籽TO、发酵后茶籽多肽Ts及维生素C的ABTS阳离子自由基清除效果如图2所示。TO、Ts对ABTS阳离子自由基清除活性存在正相关量效关系。同一浓度下，Ts的ABTS阳离子自由基清除能力显著高于TO,其ABTS阳离子自由基半抑制浓度为0.358mgmL,显著低于TO的IC50值0. 807m

12、gmL(P0. 05) o以上表明，茶籽原料经发酵水解后产生的小分子质量多肽具有更强的ABTS阳离子自由基清除能力。茶籽蛋白中富含色氨酸18,色氨酸是环状氨基酸，含有苯环，能够为自由基提供质子，减缓自由基的链式反应,推测茶籽中的蛋白质组分经微生物分解后，暴露出更多的色氨酸残基，进而赋予其ABTS阳离子自由基高清除活力19。图2不同组分对ABTS阳离子自由基清除活性Fig 2ABTSradicalscavengingactivityofdifferentcomponents2. 4. 2DPPH自由基清除活性TO、Ts及维生素C对DPPH的清除能力如图3所示。DPPH清除率随T0、Ts浓度的增加

13、而逐渐提高，不同浓度下Ts的DPPH清除率均50%,质量浓度Img/mL时的最高清除率达到85. 5%,显著高于T0。以质量浓度对DPPH自由基清除率做回归方程，得到TO、Ts、维生素C的IC50值分别为0.796、0.164、2. 4. 1ABTS阳离子自由基清除活性未发酵茶籽TO、发酵后茶籽多肽Ts及维生素C的ABTS阳离子自由基清除效果如图2所示。TO、Ts对ABTS阳离子自由基清除活性存在正相关量效关系。同一浓度下，Ts的ABTS阳离子自由基清除能力显著高于TO,其ABTS阳离子自由基半抑制浓度为0.358mgmL,显著低于TO的IC50值0. 807mgmL(P0. 05) o以上表

14、明，茶籽原料经发酵水解后产生的小分子质量多肽具有更强的ABTS阳离子自由基清除能力。茶籽蛋白中富含色氨酸18,色氨酸是环状氨基酸，含有苯环，能够为自由基提供质子，减缓自由基的链式反应,推测茶籽中的蛋白质组分经微生物分解后，暴露出更多的色氨酸残基，进而赋予其ABTS阳离子自由基高清除活力19。图2不同组分对ABTS阳离子自由基清除活性Fig 2ABTSradicalscavengingactivityofdifferentcomponents2. 4. 2DPPH自由基清除活性TO、Ts及维生素C对DPPH的清除能力如图3所示。DPPH清除率随T0、Ts浓度的增加而逐渐提高，不同浓度下Ts的DP

15、PH清除率均50%,质量浓度Img/mL时的最高清除率达到85. 5%,显著高于T0。以质量浓度对DPPH自由基清除率做回归方程，得到TO、Ts、维生素C的IC50值分别为0.796、0.164、2. 4. 1ABTS阳离子自由基清除活性未发酵茶籽TO、发酵后茶籽多肽Ts及维生素C的ABTS阳离子自由基清除效果如图2所示。TO、Ts对ABTS阳离子自由基清除活性存在正相关量效关系。同一浓度下，Ts的ABTS阳离子自由基清除能力显著高于TO,其ABTS阳离子自由基半抑制浓度为0.358mgmL,显著低于TO的IC50值0. 807mgmL(P0. 05) o以上表明，茶籽原料经发酵水解后产生的小分子质量多肽具有更强的ABTS阳离子自由基清除能力。茶籽蛋白中富含色氨酸18,色氨酸是环状氨基酸，含有苯环，能够为自由基提供质子，减缓自由基的链式反应,推测