腈水合酶底物通道入口调控催化活性的关键氨基酸位点的定位与改造.docx

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1、庸水合酶底物通道入口调控催化活性的关键氨基酸位点的定位与改造酰胺类产品具有较高的工业价值，其中，最有代表性的产品是丙烯酰胺，其单体和聚合物广泛应用于石油、水处理、造纸、纺织等行业。酰胺类产品的传统工业生产方法为化学合成，但反应条件苛刻、转化率低以及副产物产率高。随着脯水合酶的发现和研究，条件温和、选择性强的生物催化法1正逐步替代化学合成法，已成功应用于工业生产丙烯酰胺、烟酰胺和5-氟基戊酰胺等酰胺类产品2-4。睛水合酶(nitri 1 ehydratase, NHase, EC4. 2. 1. 84)是一种金属酶，可以将盾类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产应，且大多数的庸水合酶在超过5(C时

2、会迅速失活15,两者之间的矛盾一定程度上限制了脯水合酶更广泛的应用。因此，获取兼具较高酶活力和良好热稳定性的揩水合酶具有重要意义。此前，本实验室通过基因挖掘，异源表达了温泉热碱芽袍杆菌(CaldalkalibacillusthermarumTA2. A1)来源的新型耐热般水合酶,该酶在652的半衰期为3h,具有优异的热稳定性16,但野生型的催化酶活力较低。近年来，随着生物信息学工具的快速发展，越来越多的研究者运用分子动力学模拟进行理性设计改造天然酶17,确定适合突变的最佳氨基酸残基，提高酶活力以适应工业需要。PAVLOVA等18应用热碱芽抱杆菌来源的月青水合酶，为本实验室前期构建并保藏。酵母提

3、取物、胰蛋白陈，OXOID公司；感受态细胞制备试剂盒、异丙基一D-硫代瞰喃半乳糖（isopropyl- -D-thiogalactopyranoside, IPTG）、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；DNAMarker、PrimerSTARMaxDNA 聚合酶、Dpnl 限制性内切酶、Bradford蛋白定量检测试剂盒，TaKaRa公司（北京）；丙烯庸，国药集团（中国上海）；丙烯酰胺和脱硫生物素，Sigma公司；引物由苏州金唯智合成，本文所用引物和序列见表1。表1本文所用引物及其序列TableIPrimersusedinthisstudy注：引物序列中，下划线字母代表突变位点100mmol

4、LKPB 缓冲液：K2HP0413. 95g. KH2P0410. 92g,用100ns的全约束并放开平衡，步长为2ps,计算出亚基上各个氨基酸的涨落状况。对得到的轨迹文件使用VMD软件进行可视化分析，比较在不同温度下(300和360K) Cal. tNHase的B亚基的均方根波动值(rootmeansquarefluctuation,RMSF) o底物通道计算利用CAVERanalyst2. 0软件，底物通道探针半径设置为0.9A ,底物通道入口计算利用CAVER内嵌的ResidueGraph和Contour模块。氢键的计算由NAMD软件中的hydrogenbond模块完成。蛋白结构绘图软件

5、为PyM0LoRMSF曲线由0rigin2022绘制获得。1.2. 2突变体构建及表达以质粒pET-24a(+)-Cal. tNHase为模板，进行全质粒PCR(引物见表1),用Dpnl限制性内切酶消化以去除模板质粒，之后转入感受态细胞,运用Sanger测序法确认突变位点核昔酸序列将构建好的突变体转入BL21(DE3),在含有50mgL卡那霉素的LB平板上涂布，过夜培养，挑取单菌落接种到5mL含有50mgL卡那霉素的LB培养基的试管中，摇床条件设定为37C,200rmin,培养810h。试管种子液转接到含有50mgL卡那霉素的2YT培养基中，种子液接种量为1%, 37.200rmin,培养至菌

6、体浓度0D600值为0. 60. 8时，加入终浓度为0. 4mmolL的IPTG诱导蛋白表达，并将温度设置为 30,培养 16-18ho1. 2. 3酶的分离纯化及浓度检测诱导表达后的菌液用超高速离心机以10000rmin离心5min,收集菌体，用bindingbuffer重悬菌体，按比例浓缩5倍,混匀后放置于冰盒中进行超声波破碎。随后，4,12000rmin超高速离心30min ,取上清液弃沉淀，后用0.22m滤膜过滤，获得粗酶液，使用AKTA蛋白纯化仪通过strep亲和层析进行后续纯化。首先，先后用5倍体积的去离子水和bindingbuffer缓冲液以ImL/min流速清洗并平衡柱子；参数

7、稳定后上样，样品全部进入管道后换用bindingbuffer冲洗管道，直至紫外吸收值降低为0,再换用washingbuffer洗脱，收集紫外吸收值200mAU的蛋白。用SDS-PAGE方法分析鉴定纯化后的蛋白表达情况，用Bradford法测定蛋白浓度，并将蛋白统一稀释到0. 05mgmL以便后续测定酶活力。1. 2. 4酶活力检测取10 口 L纯化后的0. 05mgmL的蛋白先于25。（3金属浴下保温5min,加入490 L200olL的丙烯睛底物，25下反应10min,最后加入500uL乙脂终止反应，反应终体积为1mL。反应后样品经0. 22 m有机滤膜过滤后，用高效液相色谱测定产物生成量，

8、检测器为紫外检测（检测波长为210nm）,色谱柱为C18柱（柱温为4（TC）,流动相为乙庸和水混合溶液（乙睛与水的体积比为1 ： 2）,流速为0. 6mLmin,进样量为10 L,进样时间为10mino定义酶活力单位（U）： 25cjC下每分钟催化丙烯庸生成luol丙烯酰胺所需的酶量；定义比酶活（U/mg）：lmg纯酶具有的酶活力单位数。1.2.5热稳定性研究设置金属浴温度为659，分别保温0、2、3、5h后取样，测定剩余酶活力，以处理Oh的样品（未经热处理的酶）为对定义其酶活力为100%,依次计算其余样品相对酶活力，分析65T下的纯酶热稳定性2结果与分析2. 1突变位点的选择近年的研究发现，

9、庸水合酶的底物通道主要由亚基中的氨基酸残基构成，且底物通道对于该酶的催化性能具有决定性作用20。此外，研究理论指出，酶分子中的柔性loop区域可能对于酶的催化活性具有一定的影响21。根据上述报道，对位于膈水合酶底物通道入口处的loop结构进行研究（图l-a）oa-底物通道结构及通道入口附近关键区域（红色标出为R1区域，橙色标出为R2区域）；b-底物通道入口关键氨基酸BAsn47和BAsnl81之间的氢键图ICal. tNHase结构及底物通道模拟分析Fig. IStructuremodellingandkeyresiduesadjacenttosubstrateaccesstunnelofCa

10、l. tNHaseRMSF是指一段时间内，原子相对于参考构象的结构变化，反映了原子的自由度22。当原子位于蛋白质上时，RMSF值可以反映蛋白质中各个氨基酸的柔性强度：RMSF值越大，柔性越大23-24。通过100ns分子动力学模拟，对野生型Cal. tNHase 亚基中各个氨基酸在温度300和360K下的RMSF值进行计算。图2显示，其中，亚基上的区域Rl(Gly42-Leu48). R2 (B Asnl81-B Serl88)在 360K 时较300K时发生明显的柔性波动，为8亚基上的柔性区域。根据图1, Cal. tNHase底物通道入口 loop区域由亚基上的Gly42-Leu48七个氨

11、基酸残基构成，与区域R1位置吻合。图2野生型B亚基在300和360K下的RMSFFig. 2RMSFofwildtype subunitat300and360K着重寻找柔性区域R1和R2上的特殊作用力，发现位于亚基47位的天冬酰胺残基和181位的天冬酰胺残基在分子动力学模拟过程中会形成氢键(图-b),且持续时间较长,推测这对氢键限制了区域R1的柔性。因此，本文拟将通过位上的天冬酰胺分别突变为以下氨基酸（A、E、F、H、K、L、Q）,构建共14个突变体。在0D600=0. 5菌体浓度下，测定的各突变体相对酶活力如图3所示。图3Cal. tNHase突变体相对酶活力Fig 3Relativeact

12、ivityofCal. tNHasemutants选取其中突变为丙氨酸的2个突变体（BN47A、BN181A）和粗酶活力显著提高的4个突变体（BN47F、BN47L、BN181F、B N181K）进一步纯化（纯化后SDS-PAGE如图4所示）。图 4Cal. tNHaseSDS-PAGE 图Fig.4SDS-PAGEofCal. tNHase测定的纯酶酶活力如图5所示。其中，得到的最优突变体为BN47F,比酶活力为592.92Umg,相对野生型的比酶活力为165. 30Umg,提高了 2. 57 倍。图5Cal. tNHase突变体比酶活力Fig. 5SpecificactivityofCaL

13、 tNHasemutants2. 3 N47F突变体的热稳定性Cal. tNHase野生型及B N47F突变体的热稳定性如图6所示,野生型65。（3下的半衰期为3h,突变体BN47F65OC处理3h后仍残余56%酶活力。而嗜热假诺卡氏菌(PseudonocardiathermophilaJCM3095)来源 的月青水合酶(PtNHase)65C处理仅30min,即残余酶活力不到10%16o突变体与野生型相比热稳定性有一定的提高，尤其与其他来源的脯水合酶相比，具有较明显的优势，证明BN47F在提高酶活力的同时保持了良好的热稳定性。图 6Cal. tNHase B N47F 热稳定性Fig. 6T

14、hermalstabilityofCal. tNHase B N47F2. 4突变体催化性能提高机制解析通过蛋白质理性设计，获取了酶活力大幅提高的优势突变体N47Fo为了解析该突变体催化性能提高的机制，该研究首先通过trRosetta在线建模工具25,以来源于Bacillussp. RAPc8(PDBID：2DPP)和BacillussmithiiSC-J05-l (PDBID： 1V29)的月青水合酶晶体结构为模板，构建了 BN47F的三维模拟结构。由于0亚基上47位的天冬酰胺已突变为非极性残基苯丙氨酸，相应位点的残基侧链无法与B亚基上181位的天冬酰胺形成氢键，推测该突变破坏了原有的氢键相

15、互作用，从而解除了Cal. tNHase底物通道入口 loop区域的运动限制。在此基础上，通过对优势突变体8N47F进行100ns的分子动力学模拟发现(图7),突变体底物通道入口 loop区域的RMSF值较野生型Cal. tNHase有明显提高，即底物通道入口区域的柔性得到了提高。图7300K下野生型和突变体BN47F的RMSF值Fig. 7RMSFvaluesofwild-typeandmutant N47Fat300K利用PyMOL软件对所构建优势突变体B N47F进行分析(图8),发现突变体47位苯丙氨酸的侧链并未与其他任何氨基酸发生氢键等相互作用，表明野生型B亚基47位天冬酰胺侧链与181位天冬酰胺侧链的氢键已被成功打破。a-突变体BN47F的模拟结构；b- Phe47与周围氨基酸残基的相互作用图8突变体BN47F模型图Fig. 8Mo