10种常用细胞因子检测方法盘点.docx

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1、10种常用细胞因子检测方法盘点研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以 及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。目前检测 细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测 技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物 学方法及质谱法。细胞因子是由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、 B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮 细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛 生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和 效应，调控免疫应答。这些细胞因子的种类很多，包括肿瘤 坏死因子一Q(TNF-CI )、白介素一1 B(IL-

2、I B )、白介素一 6(IL-6),转化生长因子一B (TGF-B)等。细胞因子(CytOkine, CK)是主要由机体中固有免疫细胞 和适应性免疫细胞合成、分泌的一类具有多种活性功能的小 分子多肽或糖蛋白。细胞因子能介导细胞间的相互作用，具 有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、 调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以 及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段 的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方 法、分子生物学方法及质谱法。本篇我们就和大家一起来

3、汇总一下10种方法的技术原理及方法特点：1、7种基于免疫学的常用的细胞因子检测方法WeStemBIot法、酶联免疫吸附测定法(ELISA),酶联 免疫斑点技术(ELISpot)、超敏电化学发光技术(MSD)、 Luminex液相芯片检测技、Olink技术、Simoa技术(SimOa)7种常用的细胞因子检测方法差异对比2、2种基于生物学的检测方法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)Cytometric Bead Array (CBA )系统3、质谱法4、12项细胞因子检测的临床意义一、基于免疫学的检测方法炎症因子作为一种蛋白质抗原，可以特异性与其单克隆 抗体结合，利用抗原抗体反应检测细胞因子，近年

4、来发展比 较快，其方法包括WeStemBlot法、酶联免疫吸附测定法、 酶联免疫斑点技术、超敏电化学发光技术、LUmineX液相芯 片检测技术、Olink技术、Simoa技术。1) Western Blot (WB)Western Blot (WB),就是大家熟知的蛋白质印迹法、 免疫印迹实验。是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某 种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。WB实验的基 本核心理念是抗原抗体的特异性反应，通过变性胶 SDS-PAGE将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相 载体硝酸纤维素薄膜(NC)或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜 上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液

5、进行稀 释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用洗脱液洗脱掉多余未 结合的一抗，加入带有标记的对应二抗，这样，目的蛋白+ 一抗十二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的 位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶 蛋白的条带显现。该方法可用于蛋白质表达水平的测定，细胞定位，蛋白 质-蛋白质相互作用和翻译后修饰等研究，可实现蛋白的定性 和相对定量(半定量)，而且可以看到蛋白的分子量大小。 只要抗体可用，该方法可广泛应用于人、动物、植物等多个 物种的研究中。2) ELISAEnzyme linked immunosorbent assay (ELISA), 酶联免 疫吸附测定法，是将抗原

6、、抗体的免疫反应和酶的高效催化 反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。固定在载体表 面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性。酶标 记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性。 在实际检测时，首先将抗原或者抗体固定在固相载体上。然 后加入检测对象，让待测物质与固相化物质结合，形成固相 化的“抗原一抗体”复合物。再加入酶标记的抗体或者抗原， 与固相化的复合物结合，形成酶标复合物。最后加入底物溶 液，发生酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定 量分析。该方法有现成试剂盒，使用者只需要按照试剂盒的操作 步骤完成即可，其特异性、重复性及精密性较好，可实现Pg 级别的绝对定量。本

7、质原理上ELISA和WB都可以，但炎症因子作为蛋白质，存在浓度级的问题，太低了检测不到，或 者不能真实反映，所以细胞分泌的炎症因子一般不能用来跑 WBo3) ELISpotEnzyme Linked Immunospot Assay (ELISpot), 酶联免 疫斑点技术，细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因 子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子 与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和 素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色” 的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELlSPot酶联斑点分 析系统对斑点的分析后得出结果。该技术可以在单细胞水平

8、 对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测，能从20万 -30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。该方法关注的结 果是分泌细胞的比率(等于阳性细胞数/总细胞数)。主要用 于疫苗、细胞治疗、基因治疗等领域，是研究T细胞免疫原 性反应的主要检测方法。ELlSPOt法源自ELISA,又突破传统ELlSA法，是定量 ELISA技术的延伸和新的发展。ELlSPOt通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的 相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过 仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出 分泌该蛋白的细胞的频率。而ELlSA则通过显色反应，在酶 标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可

9、溶性蛋白总量。 该方法的样本要求是活细胞，其中细胞存活率最好不低于 80%,如果能达到90%以上更好。4) ) Meso Scale Discovery (MSD )Meso Scale Discovery (MSD)超敏电化学发光技术，基 于石墨微孔板的电化学发光免疫分析是根据ELISA基本原 理的升级，在板底通电从而激发标记物SULFo-TAG发光并 由CCDCamera进行信号采集。主要基于超敏多因子电化学 发光分析仪 MESO Sector 600 或 Quickplex SQ 120o 通过点 阵技术,在96孔石墨电极板里可实现10个指标每孔的检测。 也可在24孔板里定制实现100指

10、标/孔的筛选检测。MSD系统的灵敏度略高于流式细胞仪(CBA)系统， 可以定量自然细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、TNF- JL-12p70、 IL-IB)的循环水平，并准确回收添加到血清样本中的已知 数量的重组细胞因子。是一种电化学发光法，用于检测细胞 因子、蛋白质、抗体和核酸等生物分子，属于第三代免疫分 析技术。5) ) Luminex液相芯片检测技术该技术是结合微球和流式细胞仪的原理来检测蛋白的 一种方法，核心是将聚丙乙烯微球或者磁性微球用荧光染料 的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最 多100种具有不同荧光光谱的微球，每种微球共价交联上针 对特定抗原的捕获抗体

11、。应用时，先将针对不同检测物的微 球混合，加入待测样本后，靶分子与微球表面的捕获抗体特 异结合，每个反应孔中可同时完成最多100种检测反应。上 机时仪器通过两束激光分别识别微球的编码和微球上报告 分子的荧光信号强度，荧光强度反应微球结合的靶标蛋白的 含量，这一步用于定量。因此，利用微球技术，可以同时检 测多个蛋白。Luminex技术类似多重ELISA检测，也可以实现Pg级 别的绝对定量，可以检测细胞因子、趋化因子、转录因子和 生长因子等260多种蛋白和数以千计基因表达情况，而且一 次可以检测多种蛋白指标。6) OIink 平台该平台是基于临近延伸分析(PEA)技术，通过一对特 异性抗体结合识别

12、靶蛋白，这对抗体分别偶联DNA寡核音 酸标记，当结合在同一蛋白上的两个抗体相互靠近时DNA 寡核甘酸互补配对并结合DNA聚合酶进行扩增。最后，使 用qPCR或二代测序技术定量DNA寡核甘酸，通过特异性 的核昔酸序列信号来反应检测蛋白质的含量。CHink技术检测限可达飞摩尔(fgmL)数量级，具有高 通量、高灵敏、低体积、宽动态、支持液体活检及多样本形 式、自动化样本处理流程提供绝佳的简易性、准确性及重复 性。可用于疾病预测、病例分层、诊断及预后、筛选疾病标 志物、药物靶点等基础研究。7)分子免疫阵列技术该技术(single molecule array, Simoa )是基于微阵列芯 片的单分

13、子免疫检测，是在毫米级芯片上雕刻(或浇筑)成 千上万个微米级微井，每个微井体积约40 fl左右，随后将免 疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对 荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧 光产物孔的数量/含珠子孔总数的比值，以此确定测试样品中 的蛋白质浓度。该技术灵敏度高，与OIink技术同为目前具代表性的单 分子免疫检测技术。实现了超低丰度蛋白的有效检测和定量, 为低丰度炎症因子的实时监控提供了技术支撑。专注于神经、 免疫&肿瘤、心脏病、传染病、炎症等生物标记物检测应用 领域。二、基于分子生物学方法主要是检测细胞因子的基因表达水平，包括对其DNA 的检测和mRNA表

14、达水平的检测。对于表达低或者体内只能 得到数量极少的细胞产生的细胞因子，因其含量太低，免疫 学和生物学方法难以测定，常用的方法有SOUthem印迹、斑 点印迹、PCR,原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及 RT-PCRo这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检 测。1)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)即将 RNA 的反转录(reverse transcription )和 cDNA 的 聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。细胞因子的mRNA 寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。 RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原 理是首先以RNA为模板,在

15、逆转录酶的催化下，合成与RNA 互补的cDNAo然后已cDNA为模板，用PCR技术对靶序列 进行扩展，使微量细胞因子的RNA经放大后检出。该方法尤其适用于含量极少或容易降解的细胞因子，无 视样本类型，只需要设计好相对性的扩增引物及探针。但易 出现假阳性和假阴性，在实验中必须设严格的对照实验。且 测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平，并且不容易对细胞因子表达水平进行定量。2） Cytometric Bead Array （CBA）系统即流式编码微球芯片技术，又称细胞因子微球检测技术, 是用流式细胞仪对多重蛋白进行定量检测的方法，能够同时 对样本中的多个指标进行定性、定

16、量检测，可应用于细胞因 子检测。目前CBA检测系统采用聚苯荧光编码微球（有磁 性/非磁性）连结特定的捕获抗体，捕捉待测物，同时再加入 待测物的荧光抗体，三者形成夹心复合物，通过流式细胞仪 进行检测。CBA法的优点是同时可以进行多参数检测，快速并且信 息量大，其优势体现在能够同时对单个样本进行多种检测， 所需样本量少、灵敏度高、稳定性好等。以上我们介绍了 2种基于流式细胞术技术的细胞因子检 测方法，差异对比见下表：三、质谱法即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或 分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。因为质 谱仪器的种类多，应用范围广，其检测灵敏度极高，但目前 主要用于细胞因子检测的方法有待进一步开发，市面上主要 存在靶向蛋白质组学（PRM）方法和非靶向蛋白质组学方法， PRM检测法最多一次可检测50种蛋白质进行绝对/相对定量, 非靶向蛋白质组学方法最