DB6505T 1282023省际公路检查站高致病性禽流感监测技术规程.docx

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1、ICS65.020.20CCSB41B6505哈密市地方标准DB6505/T1282023省际公路检查站高致病性禽流感监测技术规程Monitoringproceduresofhigh1ypathogenicavianinf1uenzaatprovincia1highwaycheckpoint2023-12-30实施2023-11-30发布哈密市市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由哈密市动物疫病预防控制中心首次提出。本文件由哈密市农业农村局归口。本文件起草单位：哈密市动物疫病预防控制中心、伊吾县农业农村局。本文

2、件主要起草人：买吾兰孜克牙、陈建豪、坤巴哈斯沙合依、帕提古丽吾马尔、张国新、买木力艾力。本文件实施应用中的疑问，请咨询哈密市动物疫病预防控制中心。对本文件的修改意见建议，请反馈至哈密市动物疫病预防控制中心（哈密市八一路26号）、哈密市市场监督管理局（哈密市前进西路14号）哈密市动物疫病预防控制中心联系电话：0902-2317228,传真：0902-2317228,邮编：839000哈密市市场监督管理局联系电话：0902-2250279,传真：0902-2251069,邮编：839000省际公路检查站高致病性禽流感监测技术规程1范围本文件规定了开展高致病性禽流感临床诊断、样品采集、保存与运输、实

3、验室检测、疑似高致病性禽流感的处理和消毒的技术要求。本文件适用于哈密市域内省际公路检查站开展高致病性禽流感的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术NY764高致病性禽流感疫情判定及扑灭技术规范NY/T765高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范NY/T768高致病性禽流感人员防护技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11高致病性禽流感high1ypathogenicavian

4、infIuenza由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。实时荧光RT-PCRrea1-timeRT-PCR利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法。Ct值cyc1ethresho1d每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。4临床诊断d1临床症状4.1.1 精神沉郁，嗜睡，可见扭颈等神经症状；呼吸困难，有呼吸道症状。4.1.2 鸡冠发绡或出血，头部水肿，角膜发红。4.1.3 1,3脚鳞出血。4.2.1气管弥漫性充血、出血，有黏液。4.2.2腹腔内有浑浊的炎性分泌物；卵泡充血、出血、破裂，有的可见卵黄性腹膜炎；胰腺边缘有出血、坏死。4 .2

5、.3心外膜及冠状沟出血；腺胃、肌胃交界处出血，腺胃乳头出血；直肠黏膜及泄殖腔出血。A?结果判定出现临床诊断和病理变化中的情况，可判定为高致病性禽流感临床疑似病例。5 样品采集、保存和运输1采样原则与通用要求5.1.1 检查站对运输的禽类进行临床检查时，发现高致病性禽流感临床疑似病例的禽只时，进行样品的采集。5.1.2 应采集具有典型临床症状的禽只样品，病死禽采集气管、肺脏、脑等组织样品，活禽采集喉气管拭子和泄殖腔拭子，小珍禽可采集新鲜粪便。5.1.3 采样过程中人员防护应按照NY/T768的规定执行。R）样品采集5.2.1组织样品无菌采集禽只的气管、肺、脑和肠管（包括内容物），分别装入无菌采样

6、袋或其他灭菌容器，编号并填写禽流感监测采样单（附录A）o5.2.2拭子样品5.2.2.1采集咽喉拭子时将棉拭子深入喉头轻轻擦拭3至5次并旋转，取咽喉分泌液。5.2.2.2采集泄殖腔拭子时将棉拭子深入泄殖腔转一圈，沾取少量粪便。5.2.2.3将同一禽只采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子同时放入盛有1.21磷酸盐缓冲液（含青霉素10000IUm1,链霉素10000IUm1）的2m1离心管中。PH7.4的磷酸盐缓冲液配方见附录Bo5.2.2.4每只禽采集两份拭子样品，编号并填写禽流感监测采样单。5.2.3粪便样品采集新鲜粪便样品（2g左右）置于盛有1.2m1磷酸盐缓冲液（含青霉素10000IUm1,链霉素1

7、0000IUm1）的2m1离心管中，编号并填写禽流感监测采样单。44样品保存和运输采集的样品放入保温箱中，加入预冷的冰袋，立即送往实验室进行样品的制备，备份样品置-70C冻存。样品的保存与运输应按照NY/T765的要求执行。6实验室检测A1检测方法采用禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验检测禽组织、分泌物、排泄物等样品中禽流感病毒核酸。A9样品制备6.2.1拭子样品用高压灭菌镜子充分捻动或涡旋震荡使其充分混合，若样品较为浑浊，3000r/min离心10min,取上清转入1.5m1无菌离心管中待用。6.2.2组织样品取2g左右于干燥、灭菌的研钵中充分研磨，加入10m1璘酸盐缓冲液，4,3000r/

8、min离心15min,取上清转入1.5m1无菌离心管中待用。A1病毒核酸提取6.3.1应用市售商品化检测试剂盒配套使用的柱式抽提试剂盒，按使用说明书人工提取病毒核酸。6.3.2应用市售商品化自动提取试剂盒，按使用说明书在自动核酸提取仪上进行编程并提取核酸。A4扩增试剂的配制按GB/T18936推荐的方法配制实时荧光PCR扩增试剂或选用市售商品化禽流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒。A勺实时荧光RT-PCR扩增检测推荐实时荧光定量RT-PCR反应条件：45eC反转录15min,预变性952min；9515s,6060s；在每个循环的第二步(60C60s)收集荧光信号，共40个循环。选用商品化禽流

9、感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒的参照说明书操作。AA结果分析条件设定读取样本检测结果。一般为自动设置阈值，也可根据正常阴性样本扩增曲线合理调整阈值。A7质控标准6.7.1阳性对照Ct值W30并出现特异性扩增曲线6.7.2阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线6. 7.3同时满足以上两个条件，实验结果成立。AA结果判定6.8. 1未知样品有特异性扩增曲线且Ct值W30,判定为阳性。6.8.2未知样品有特异性扩增曲线且30Ct值35,判定为可疑，重复测定后仍在可疑区间的样本判为阳性。6. 8.3未知样品有特异性扩增曲线且Ct值35,判定为阴性。A0结果的出具及时出具检测结果，认真填写检测结果记录单

10、(附录C)。A1检测结果的报告6.1.1 若检测结果为阴性，将检测结果上报本站负责人。6.1.2 若检测结果为阳性，将检测结果逐级上报，并做好相关信息登记。7疑似高致病性禽流感的处理71对高致病性禽流感临床疑似病例运输车辆、家禽实施隔离、监控，禁止运输人员、车辆和家禽随意移动，并对其外环境进行严格消毒。79病原学初检为阳性的样品,送自治区动物疫病预防控制中心复检,并送国家指定参考实验室确诊。71对于确诊为高致病性禽流感疫情的，按照疫情判定及扑灭技术规范NY/764执行。8消毒R1车辆和场地的消毒8.1.1 对车辆、停泊场所、道路的消毒，可采用碱类、氯化物和酚化物等消毒剂，以清洗、喷洒等方式消毒

11、。8.1.2 室内、实验室（含精密仪器）消毒，可采用过氧化氢雾化消毒和紫外线照射等方式消毒。R9人员及物品消毒8.2.1参与相关工作人员的手及皮肤裸露的部位进行清洗、消毒，回到驻地后进行淋浴消毒。8.2.2衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取喷洒、浸泡和洗涤等方式消毒。附录A（资料性）禽流感监测采样单禽流感监测采样单检测结果记录单禽流感监测采样单动物样品采集登记表（采样单编号）采样时间：年月曰时分No:（检疫证编号）采样地点受检车牌号动物种类车载动物总量畜主签字联系方式输出地车主签字联系方式输入地途中有无装卸装卸时间、地点样品种类咽喉/泄殖腔拭子粪便组织样品数量免疫情况临床症状及病理变化样品名

12、称品种日龄装车部位采样数量编号起止采样人：联系电话：附录B（规范性）PH7.4的磷酸盐缓冲液的配制B.1A液0.2mo1/1磷酸二氢钠水溶液。NaH2PO1-H2O27.6g,溶于蒸储水中，最后定容至1OoOm1oB2B液0.2mo1/1磷酸氢二钠水溶液。Na2HPO17H2O53.6g,或Na2HPO412H2O71.6g,或Na2HPO,2H2O35.6g,溶于蒸储水中，最后定容至1000m1oB.30.01moI/1xpH7.4磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2mo1/1A液14m10.2mo1/1B液36m1加氯化钠8.5g用蒸储水定容至1OOom1o经121、15min高压灭菌后室温保存

13、。附录C（资料性）检测结果记录单检测结果记录单记录单编号：受检车牌号；畜主/车主：联系电话：检测时间：检测完成时间：样品名称：样品数量：检测项目：执行标准：试剂名称：试剂批号：试剂厂商：试剂效期：仪器名称：样品状态：荧光PcR结果：原始编号检测值检测结果原始编号检测值检测结果阴性对照阳性对照判定文件：检测结果高致病性禽流感病毒核酸：应用荧光RT-PCR实验方法检测咽喉、泄殖腔拭子样品_份，其中_份高致病性禽流感病毒核酸疑似阳性，_份高致病性禽流感病毒核酸阴性。注：检测记录单编号具有唯一性，每辆受检运输车给予一个编号，编号原则：年份+月份一JXXX1J表示监督检测，XXXX为序号，从Ooo1开始，直至本月结束，次月再从OOO1开始编号。编号形式，如202301JOOo1。检测人：校核人：审核人：年月日