Zn2+胁迫对花斑裸鲤抗氧化关键基因表达和抗氧化酶活性的影响.docx

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1、摘要:为探讨水体Zn对鱼类的影响，并筛选出有效的生物标记物，以花斑裸鲤GymnocyprisecAo幼鱼(体质量为10g3g)为试验对象,分别以1、2、5、10、20mg1ZIF为胁迫浓度，计算24、48、72、96h时的半致死浓度(1Dj,经1mg/1Zrr胁迫12、24、48、72、96h后，采用qPCR技术检测鳏、肾脏和肝脏组织中抗氧化防御系统相关的核因子E2相关因子2(Nrf2)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZ-S0D).镒超氧化物歧化酶(Mn-SOD).过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达量变化，以热图分析各基因在3种组织中的应答层次，以及用吸光度法测定SOD、CA

2、T和GPX抗氧化酶活性的变化。结果表明：Z1r对花斑裸鲤幼鱼胁迫24、48、72、96h时的半致死浓度(1DD分别为5.0、3.2、2.5、2.0mg/1,安全浓度为0.2mg/1；在Zrr胁迫96h内，花斑裸鲤Nrf1.CuZn-S0D.Mn-S0D.和的基因表达量及SOD、CAT和GPX酶活性均有不同程度的升高，但升高幅度各异；基因表达量热图分析显示，与鲤、肾脏和肝脏组织中的4个下游基因表达量相比，Nrf1表达量相对较低，尤其在肾脏和肝脏组织中表现更为明显。研究表明，花斑裸鲤Ar/2、Cu/Zn-SOD.Mn-S0D.OT和G&基因表达量及相关酶活性与Zn胁迫存在一定的时间相关性和组织特异

3、性，其可作为预警水体Zrr污染的备选生物标记物。关键词：花斑裸鲤；锌离子；重金属离子胁迫；抗氧化酶基因表达；生物标记物重金属因其潜在毒性、难降解及富集等危害，已成为重要的环境污染源。研究表明，通过重金属的瞬时超标或者长期微量积累常常对鱼类产生胁迫，影响早期生长发育，如增加胚胎发育时间、降低胚胎孵化率、增加畸形率等，并引起鱼体组织细胞(如肝细胞、鲤和性腺等)超微结构的损伤。重金属污染物对鱼类胁迫造成的危害因重金属离子种类、胁迫浓度、胁迫时间和鱼种等因素变化而不同。水体中重金属离子浓度超过一定阈值时，其毒理效应会表现出来，并造成水生动物受伤、死亡O锌是生命活动所必需的微量元素之一，具有催化和调节功

4、能，在营养物质代谢过程中发挥重要作用，也是纠正免疫应答功能的关键元素。当ZrF缺乏时，会导致中性粒细胞和单核细胞的趋化性降低，细胞免疫反应受损。但是，当Zr浓度超过一定浓度时，也会抑制水生生物的生理功能。Zr对鱼类的毒害作用与其和鱼类体内生物大分子上的活性位点结合有关，表现为鱼卵的孵化、发育和繁殖过程受阻，甚至死亡。在Zir胁迫下，鱼体会产生一种非特异性免疫机制以应对Zrr引起的免疫和氧化损伤。多种环境污染物可诱导水生生物产生氧化应激进而产生活性氧(ROS),同时产生脂质过氧化、细胞损伤等一系列生理生化反应，因此，氧化应激和抗氧化酶活性水平常作为评价环境风险的重要指标。核因子NF-E2相关因子

5、(nuc1earfactor-erythroid2-re1atedfactor2,Nrf2)属于CNC亮氨酸拉链家族(CapnCo1Iarbasic1eucinezipper,CNC-bZIP)成员，是细胞内缓解氧化损伤和抵抗外来毒性化合物的重要核转录因子，通过调节相关靶基因的表达参与机体内抗氧化和抗炎应激反应、重金属解毒等生理过程。Nrf2可通过调控一系列抗氧化蛋白因子的组成型和诱导型表达，减轻活性氧和亲电体引起的细胞损伤，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡。但金属暴露会影响Nrf2介导的细胞信号通路，包括KeaPI中疏基的还原、MAPK活性的激活、Nrf2的磷酸化等。机体在受到胁

6、迫应激时，MV2基因被激活并转运入核，调控包括超氧化物气化酶（S（M）、过氧化氢酶（。7）和谷胱甘肽过氧化物酶（G&）等下游抗氧化靶基因的转录，保护机体免受氧化损伤oNrf1mRNA表达的上调主要是由核易位造成的，核易位由氧化信号诱导，重金属胁迫促使氧化信号增多，导致核易位细胞数量增多。研究发现，重金属胁迫会诱导相关抗氧化基因。7、GPx、CuZnSOD和MnS阳等表达水平显著增加,以及抗氧化酶SOD和CAT等酶活性显著升高,而这些基因表达水平的上调与Nrf2Keap1信号通路有关，因为Nrf2与KeaP1的解离是Nrf2核易位的主要机制。因此，研究鱼类对重金属胁迫的分子应答机制，有助于筛选出

7、评估水体污染状况的分子标记物,掌握鱼类生存状况，提供水体污染预警，为鱼类保护和资源恢复提供对策。花斑裸鲤GymnocyprisecA俗称大嘴鱼，隶属于裂腹鱼亚科Schizothoracinae裸鲤属Gymnocypris,分布于黄河上游段、扎陵湖、鄂陵湖等淡水水域，是黄河上游水域中生物多样性的重要组成部分，具有重要的生态保护价值和开发利用价值。近年来，由于大型水利工程的建设、人为的偷捕乱捞和水环境的局部污染，花斑裸鲤资源量大幅度减少o目前，国家通过实施花斑裸鲤等土著鱼类“三场”（即产卵场、索饵场、越冬场）的生态修复工程，建立了花斑裸鲤人工增殖放流站，严格执行渔政执法，使得人为因素对土著鱼类造成

8、的危害得到有效缓解，而水域环境污染物尤其是重金属污染对土著鱼类的影响日益受到关注。近年来，虽然黄河上游青海段水质符合国家渔业二类水质标准，但局部水域因采矿、雨水冲蚀、生活污水和地表径流等污染会引起瞬时的重金属离子浓度超标或某些重金属离子的长期微量污染风险依然存在，尤其是繁殖季节产卵场的重金属污染直接威胁着花斑裸鲤等土著鱼类的生存。野生花斑裸鲤的孵化、发育和繁殖是其资源保护和恢复的关键，因此,本研究中选择对野生花斑裸鲤繁育活动影响最直接的Zir作为重金属胁迫源，通过分析Z1r胁迫下花斑裸鲤特定组织抗氧化关键基因和关键酶的应答模式，筛选产生胁迫应答的生物标记物，从而更加直接地反映所在水体的Zr污染

9、状况，以期为花斑裸鲤的资源保护与恢复，以及作为水质监测预警指标提供科学参考。1材料与方法1.1 材料试验用花斑裸鲤由青海省渔业环境监测站提供，取体格健康的花斑裸鲤，体长为（153）Cnb体质量为（103）g,于青海大学生态环境学院水生实验室水族箱内暂养适应两周，期间每天10:00投喂一次。试验用水为曝气一周的自来水，溶解氧为6.87.8mg1,pH为6.87.5,温度为（182）。试验前用高铳酸钾（1200mg1）对试验水族箱进行消毒处理。1.2 方法1.2.1急生毒性试验ZnSO.7HO购自Sigma-A1drich公司(St1ouis,MO,USA)O采用静态水质接触法进行金属胁迫试验。Z

10、rr胁迫浓度以中国渔业水质标准(Zn质量浓度为0.1mg1)为基准，分别将质量浓度扩大10、20、50、100、200倍，即1、2、5、10、20mg1,每个质量浓度设置一个平行组，每组投放15尾健康的花斑裸鲤。试验期间观察并记录Zir胁迫24、48、72、96h时鱼的死亡数，并观察鱼体的活动状况，以鱼静卧鱼缸底部，不见鲤盖有呼吸运动，多次触碰无反应来判断鱼死亡现象。及时捞出死亡个体，记录死亡数量。采用改进寇氏法公式计算出各胁迫时间下的半致死浓度(1DSo,mg1),安全浓度为96h1Dw0.Io1.2.2 Ux浓度的计算根据所记录的鱼死亡数，计算出死亡率。改进寇氏法计算公式为1D1g-(0.

11、5)o其中:一为Ig(最大剂量)；N.为IgdTg力d为相邻两组剂量;P为各胁迫组花斑裸鲤的死亡率(用小数表示)；P为各组户的总和。IgUk的标准误(S)计算公式为Sm=X(P3)(-1),t,UX的95%可信限=Ig(照1.96s),1DW的平均可信限=1限(1土高限-1限低限)/2。其中：为每组中鱼的数量；及二Ig1D1.2.3 样品的采集根据本试验中获得的Z1r胁迫不同时间段的半致死浓度，并以中国地表水质量标准第I类(GB/T1484893)为标准，将Z1r质量浓度为1.0mg/1作为本试验胁迫浓度。在1.0mg/1Zrr胁迫12、24、48、72、96h时，采集不同胁迫时间下的鳏、肾脏

12、和肝脏组织，用液氮速冻后保存在-80C超低温冰箱中，用于后续试验。1.2.4总RNA提取用RNA提取试剂盒(TaKaRa,Japan)提取总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪检测RNA的完整性和质量。1.2.5 荧光定量PCR设计实时荧光定量PCR引物(表1),以-,心力为内参基因,用荧光定量PCR仪(1ightCyC1er96SW11,罗氏)测定Nrf1、Cu/Zn-SOD、MnSOD、OT和GPx的mRNA表达量变化。PCR扩增总体系(共25u1)：iQSYBRGreenSupermix12.51,上、下游引物(10UnIo1/1)各11,模板21,dd08.51o反应条件为：94C

13、下预变性3min；94下循环变性30s,60下退火复性30s,72C下延伸40s,共进行40个循环。每个样本设置3个平行。运用2川法计算基因的相对表达量。表1qPCR检测的基因及引物序列Tab.1GenesandprimersequencesusedforqPCR基因引物序列产物长度bpgeneprimersequence(51-31)product1engthF：GTGGCGCCCixJ1R：TTCTCCTTCTTCTC(JCTCCF：GGTCAACGCTCAGGGACAGTCA1R：TTCC(XCTGCTCAAGGTCA14bF：CGGATACGGATCGCAcAeCT150(/匕TR；A

14、gtaatccgggtccgtggatc;Cu/ZnSODFsGtccgcacttcaaccctca240R：CCC(XCATCGTCTCTCMn-SODF：TTCACCACAGCAA(iCACCAT260R：AGeCGACATCTTeTeCTTCA-actinF：CcatgtacgttgccatccagR：CGCGCTCCTCCC44。1.2.6 基因的应答层次分析试验材料与方法同“1.2.3”节和“12.5”节。基因的应答层次以热图方式呈现。将各基因在鲤、肾脏和肝脏组织中的RNA表达量进行1og：均一化处理，然后将所得试验数据应用Hen1110.3.7软件进行分析作图。基因表达的强弱采用不

15、同颜色表示，可直观地分析出同一基因mRNA表达量的变化趋势和不同基因mRNA表达的先后层次。1.2.7 抗氧化酶活性分析用电动匀浆器分别对已得到的花斑裸鲤鲤、肾脏和肝脏组织进行匀浆。按照南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行操作，并用吸光度法测定SOD、CAT和GPX酶活性。1.3数据处理基因的mRNA表达量及抗氧化酶活力数据采用平均值土标准差(meanS.D.)表示，采用SPSSStatistics22软件进行单因素方差分析，采用SNK法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05o2结果与分析2.1 Zn,对花斑裸鲤的急性毒性影响从表2可见：不同ZIr浓度胁迫24、48、72、96h时，花斑裸鲤表现出不同的死亡率，其中，1mg1Zrr胁迫96h内，花斑裸鲤未出现死亡现象；2mg/1Zrr胁迫48h内，花斑裸鲤未出现死亡，胁迫72h时出现7%的死亡率；5mg/1Zn-胁迫24h时，出现26.7%的死亡率，胁迫48h死亡率为46.6%,胁迫96h时累积死亡率达到93.3%；10、20mg/1Zir胁迫24h时，花斑裸鲤全部死亡。表2不同Zn：质量浓度下花斑裸鲤的死亡率Tab.2Morta1ityrateofeck1oninakedcarpG