传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用.docx

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1、摘要：为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreasnecrosisvirus,IPNV)的检测方法，以GenOgrOUPI型的IPNVChRtm213分离株基因组RNA为模板，利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNVVPi基因序列(711bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体，利用大肠杆菌Rosetta进行VP3蛋白表达，以纯化的VP3蛋白为免疫原制备鼠抗血清，利用酶联免疫吸附法(enzyme1inkedimmunosorbentassay,E11SA)对抗血清效价进行测定，并利用间接免疫荧光抗体法(indirectimmunofIuorescentantibody

2、test,IFAT)和中国不同地区的IPNV分离株，对抗血清识别中国现行IPNV分离株的能力进行免疫学鉴定。结果表明：SDS-PAGE分析显示，表达纯化的VP3蛋白条带单一，相对分子质量约为45000,与理论值相符；抗血清效价分析显示，所制备的鼠抗IPNVVP3血清与IPNV的反应效价为16000,与纯化的IPNVVP3蛋白的反应效价为32OO0；间接免疫荧光抗体法分析显示，制备的鼠抗血清能够特异性识别中国不同地区的GenOgrOUPI和GenogroUPVIPNV分离株，且该血清不与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSv)发生交叉反应，具备较好的特异性。研究表明

3、，本研究中利用原核表达系统表达的IPNVVP3蛋白具有良好的免疫原性，所制备的IPNVVP3抗血清能够特异性识别中国不同地区的IPNV分离株。关键词：传染性胰脏坏死病毒；蛋白表达；VP3蛋白；免疫原性传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreasnecrosisvirus,IPNV)属于双RNA病毒科Birnaviridae水生双RNA病毒属Aquabirnavirusf是引起传染性胰腺坏死病(infectiouspancreaticnecrosis,IPN)的病原体，其主要危害鲤鳞幼鱼，致死率高达70%以上,同时也可使成年鞋鳞及许多其他鱼类发生严重的急性感染，此外，在一些软体动物和

4、甲壳动物中也分离到了IPNVo传染性胰脏坏死病于20世纪50年代在美国首次暴发，目前，该病已在欧洲、亚洲和非洲广泛流行。1986年在中国山西省某虹鳞OncorhynchusRyAss渔场首次暴发传染性胰腺坏死病(IPN),随后在甘肃、山东、辽宁、云南和四川等省份接连暴发了该疫情，患病虹醇死亡率高达90%,给鲤醇养殖业带来了巨大的经济损失。IPNV基因组由A、B两个线性dsRNA分子组成，A链编码非结构蛋白VP5和pVP27P47P3多聚蛋白前体,其中，VP4作为病毒蛋白酶将多聚蛋白切开释放结构蛋白VP2和VP3；B链编码聚合酶蛋白VP1o许多学者已对VP2蛋白的结构和功能进行了研究，并首先确定

5、了VP2蛋白是IPNV的主要保护性抗原。Tarrab等利用抗VP3单克隆抗体检测到病毒粒子表面有部分VP3蛋白存在；Park等研究发现，VP3蛋白也存在中和抗原表位；MOOn等用纯化后的VP3和VP2蛋白分别免疫虹鳗，也证明VP3蛋白和VP2蛋白一样，具有中和抗原表位，且具有较好的免疫原性。因此，VP3蛋白也是IPNV重要的保护性抗原。尽管IPNV在中国流行多年，但是目前中国仍无有效防控传染性胰脏坏死病的药物，对待该病的防控方法主要以切断病原传播为主，故而对IPNV的全面监测尤为重要。目前，全球IPNV可分为6个基因型(GenogroupIgenogroupVI),共包含9个血清型,不同基因型

6、IPNV毒株的基因序列差异较大，核酸检测方法在IPNV检测中具有一定的局限性，较难实现使用一对引物覆盖所有基因型的IPNV毒株。因此,极有必要丰富IPNV的检测方法，为IPNV的有效监测提供保障。本研究中，选取IPNV毒株ChRtn1213,利用大肠杆菌对其的基因进行体外表达及纯化，同时制备鼠抗血清，并成功将该血清应用到中国不同地区GenogroupI和GenogroupV型IPNV分离株的免疫学鉴定，旨在为IPNV的监测提供保障。1材料与方法1.1 材料本研究中所用IPNV和传染性造血器官坏死病毒(IHNV)均由黑龙江省水产动物疾病与免疫技术重点实验室在中国养殖虹鳍流行病学调查过程中分离保存

7、，其中，IPNV-QH.IPNV-1N和IPNV-GS的基因型为GenogroupV,ChRtm213、IPNV-J1和IPNV-H1J的基因型为GenogroupIO病毒性出血性败血症病毒(VHSV)毒株购自中国典型培养物保藏中心。大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(ChinOOksa1monembryoce11s,CHSE214)由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害研究室曾令兵教授惠赠；大肠杆菌DH5Q和Rosetta菌株及pET-32a表达载体均由本课题组保存。pMD19-Tsimp1e载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、PrimeScriptwOneStepRT-PCRKitVer2.0均购

8、自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物纯化及胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司；HRP标记的羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司；其他化学试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 引物设计根据IPNVChRtm213毒株隐基因序列(NCB1登录号：KX234591),利用PrimerPremier5.O软件设计扩增IPNVVPS基因的引物。上游引物VPi-V带有民血1I酶切位点：5Ggatccatggacgcagaactgcaagggctgc3；下游引物的-R带有SaII酶切位点：5,Gtcgaccacttctccgtcatcgccggag3,。引物均由哈尔滨

9、博仕生物公司合成。1.2.2 IPNVVPi基因的克隆及表达载体构建以实验室保存的IPNV(ChRtm213)RNA为模板，以的-F和的-R为引物，利用一步法RT-PCR试剂盒克隆获得至ORF,胶回收纯化后与PMD19-TSimPIe连接，菌液经PCR和测序鉴定后，将测序正确的质粒命名为PMD19-T-展。将pMD19-T-7B和表达载体pET-32a分别利用BanHI和Sa/I限制性内切酶消化并回收，将使用T4DNA连接酶连接后的产物转化至大肠杆菌DH5中，涂布于含氨节西林的琼脂糖固体培养基，于37C下过夜培养后挑取单菌落，进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的菌液扩大培养并提取质粒，对质粒进行为

10、加I和/I双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pET-32a-7Bo1.2.3 IPNVVP3蛋白的表达与纯化将重组PET-32a-的质粒转入大肠杆菌ROSetta中，于37下以IOormin振荡培养。当菌液ODW值达到O.30.4时，加入IPTG诱导剂（终浓度为0.25mmo1到）继续培养。诱导后5h内每小时收集1m1菌液，同时收集未诱导菌液作为阴性对照。经超声破碎后，将全菌、上清及沉淀样本用质量分数12%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，以分析VP3蛋白的表达情况。超声破碎后的上清液使用银离子亲和层析柱纯化，依次使用含有10、20、30、40mmo1/1咪噬的洗涤液洗涤层析柱以去除杂蛋白，然

11、后利用含有250mmo1/1咪哇的洗脱液收集目的蛋白，放入PBS溶液中（PH8.0）透析24ho透析结束后，于4C下以12000r/min离心5min,收获的上清液即为纯化的VP3蛋白，用紫外分光光度计测定纯化后蛋白的浓度。利用质量分数12%的SDS-PAGE电泳分析VP3蛋白的纯化情况。1.2.4 IPNVVP3蛋白抗血清的制备将纯化后的VP3蛋白无菌过滤，采用0.5mg/kg的免疫剂量，根据文献14中的方法对Ba1b/c小鼠进行皮下多点注射。将重组VP3蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后免疫小鼠；免疫10d后进行第2次免疫，将重组VP3蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，完全乳化后免疫小鼠；

12、第2次免疫10d后进行第3次免疫，免疫方式与第2次相同；第3次免疫10d后，通过眼球取血的方式收集免疫小鼠血液，进行血清分离，同时以PBS替代抗原免疫的小鼠血液制备的抗血清作为阴性对照。1.2.5 IPNVVP3蛋白抗血清效价检测用IPNV病毒悬液和重组VP3蛋白分别进行包被，根据文献14中的酶联免疫吸附法（E11SA）检测抗血清蛋白效价。将“12.4节”中制备的鼠抗血清进行梯度稀释（体积比分别为1：500、1:1000、1：2000、1：4000、1:8000、1：16000、1：32000、1:64000、1：128000）,与包被的酶标板于37下孵育1ho然后与HRP标记的羊抗鼠IgG（

13、I：10000,稀释）于37C下孵育1h,用PBS洗去未被吸附的二抗，最后加入TMB底物液进行显色，置于37暗箱中反应5min,每孔加入50U1终止液。终止反应后于490nm下测定OD值。阴性对照为免疫PBS与佐剂的鼠血清，空白对照为PBS。当ODi所读数值符合（阳性孔-空白孔）/（阴性孔-空白孔）2.1时，判定样本为阳性，阳性血清最大稀释倍数即为抗血清效价。1.2.6 抗血清的应用将所制备的抗血清应用到中国不同地区分离到的不同基因型的IPNV分离株的间接免疫荧光抗体法QFAT）检测中。在CHSE-214单层细胞爬片上接种本实验室分离的6株IPNV毒株和IHNV、VHSV,在接毒后72h取出接

14、毒细胞爬片。将制备好的接毒细胞爬片用体积分数为4%的多聚甲醛固定，用PBS（PH7.0）缓冲液洗涤3次，用体积分数为0.3%的BSA染色溶液于37C下封闭1h,再用PBS缓冲液洗涤，加入500倍稀释的鼠抗VP3蛋白血清作为一抗，37C下孵育1h,再用PBS缓冲液洗涤，将FITC标记的羊抗鼠IgG抗体稀释500倍后作为二抗，37C下避光孵育1ho最后用PBS缓冲液洗涤后置于荧光显微镜下观察。设置阴性血清孵育的细胞作为阴性对照。2结果与分析2.1VPi基因的克隆及表达载体的构建以IPNVChRtm213RNA为模板，据-F和阳-R为引物扩增至ORF,经10g/1琼脂糖凝胶电泳，结果显示，获得了符合

15、目片段大小的PCR产物（71IbP）（图1）。利用Ba砒I和Sa/I对重组质粒pET-32a-摩2进行酶切鉴定，结果获得与3基因和表达载体pET-32a大小相符的特异性条带（图2）,说明已成功构建了用于的原核表达的重组质粒。M12VP320001000750500Fig.1Amp1ificationoftheM1I234MOOOO5O21bpoo005000O07521M-D12000DNA分子量标准；1一阴性对照；2的基因的PCR产物。MD12000DNAmarker；1negativecontro1；2PCRproductofVP3gene.图1/3基因的PCR扩增照geneM1-D120

16、0ODNA分子量标准：M：D115000DNA分子量标准：I-BamI单酶切；2Sa1I单酶切；3-BankI和Sa1I双酶切；4pET-32a-JTB质粒。MD12000DNAmarker：MD115000DNAmarker：1sing1e-digestionbyBankIenzyme;2-sing1e-digestionbySa1Ienzyme：3dua1-digestionbyBaniIenzymeandSa1Ienzyme：4pET-32a-VP3p1asmid.图2pET-32a-重组质粒的酶切鉴定Fig.2IdentificationofpET-32a-VPibydigestion2.2VP3蛋白的诱导表达将阳性pET-32a-隐重组质粒转入大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,对表达产