刺参腐皮综合征发生的分子调控机制研究进展.docx

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1、摘要:2003年以来，海参产业发展速度和拓展规模均达到前所未有的水平，在国内形成了继海带、对虾、扇贝、海水鱼类养殖之后“第五次”海水养殖产业浪潮。伴随着养殖规模和密度的扩大，病害问题也日益凸显，已逐渐成为海参产业健康发展的瓶颈，对生态环境和食品安全威胁巨大，其中以腐皮综合征最具代表性。本文梳理分析了刺参ApostichopusJam”/CUS腐皮综合征的主要病原，系统阐述了刺参应对病原感染的免疫调节机制和代表性病原致病机制研究进展，总结了刺参病害的生态防治方法，并在实现刺参产业健康可持续发展、病原致病机制及环境调控疾病发生研究等方面提出了相应发展对策，以期为构建绿色健康的刺参疾病防控策略提供参

2、考。关键词：刺参；腐皮综合征；灿烂弧菌；免疫调控；生态防控海参为无脊椎动物，隶属于棘皮动物门海参纲，具有六亿多年的历史，全世界约有1200余种，其中印度洋、西太平洋海区是世界上海参种类最多、资源量最大的区域。刺参ApostichopusJaponicusSe1enka(1867)作为海参纲的主要经济养殖品种，位列世界八大珍品之一，也是中国主要消费的海参品种，具有悠久的饮食历史和文化。刺参重要的经济和文化价值极大地推进了其养殖业的发展，20世纪90年代，山东和辽宁沿海地区出现了刺参的规模化养殖；2011年开始，刺参养殖开始逐渐向福建和浙江拓展，成为刺参规模化养殖的新兴地区。目前，中国刺参养殖区主

3、要集中在辽宁的大连、盘锦、锦州、葫芦岛等,山东的烟台、青岛等，福建的霞浦等。根据2023年中国渔业年鉴统计显示，2019年中国刺参养殖产量为1717X10Y,苗种产量为5.25XIO头，经济产值达到300亿元，已成为中国海水养殖业的重要支柱产业。不仅如此，还开拓了以新加坡、中国香港、韩国、日本、美国、菲律宾、印度尼西亚等国家和地区为中心的贸易和消费市场。然而，伴随着养殖规模和密度的扩大，病害问题也日益凸显，其中首当其冲的就是刺参腐皮综合征,每年给刺参养殖业造成的经济损失高达3040亿元，逐渐成为刺参产业健康发展的瓶颈，对生态环境和食品安全也造成巨大威胁因此，构建绿色健康的刺参疾病防控策略意义重

4、大。本文中，依托作者团队十余年的研究进展，综述了刺参免疫防御途径和代表性病原致病机制研究进展，同时衔接环境因子对宿主和病原的调控作用，旨在为刺参病害绿色防控和未来研究提供指导和帮助。1刺参腐皮综合征流行病学调查及病原鉴定中国水产科学研究院黄海水产研究所从2002年首次开始针对山东地区养殖刺参疾病进行了流行病学、病原学和防治策略的研究，到目前为止，已对刺参养殖各阶段的易发病有了较为系统的理解。11流行特征刺参腐皮综合征(Skinu1cersyndrome,SUS)是当前对刺参养殖产业危害最为严重的疾病，又称化皮病、烂皮病等。该病于2003年2月在山东省荣成首次发生，自2004年开始在全国范围内大

5、规模暴发，波及中国从北方到南方的主要刺参产区。流行病学调查发现,该病多发生于每年水体温度较低的14月份（此期水温一般在8C以下），13月份为该病的高峰期，发病快且涉及养殖区广，一旦发病很快就会蔓延全池，死亡率高达90%以上，属急性死亡。1.2病症该病的发病症状一般分3个阶段,发病初期刺参厌食并伴有“摇头”现象，口部出现局部感染并肿胀，口围膜松弛，触手黑浊，对外界刺激反应迟钝，活动能力和附着力变弱；中期感染的刺参身体收缩、僵直,口部出现小面积溃疡并形成白色斑点，肉刺发白，此时大部分刺参出现排脏现象；感染后期随着病情的加重，刺参体表溃烂部位增多，出现大面积溃烂，最后死亡，并自溶为“鼻涕状”的胶体，

6、附着物上留有一白色印痕（图1）OA一健康刺参；B、C一腐皮综合征I期；D、E一腐皮综合征II期；F、G一腐皮综合征III期；BN一体壁；N正常组织。A-hea1thyseacucumber;BandC-SUSstageT;DandE-SUSstageII;FandGSUSstageITT;BWbodywa11;Nhea1thytissue.图1刺参腐皮综合征发展特征Fig.1Deve1opmentcharacteristicsofskinu1cersyndrome(SUS)inseacucumberApostichopusJaponicus1.3病原目前，已经鉴定的刺参腐皮综合征病原主要有以灿

7、烂弧菌Vibriosemf出S为典型代表的弧菌Vibriosp.,以及假交替单胞菌属细菌Pseudoa1teromonasIiigrifaciens和嗜水气单胞菌AeromonasHydroph1ia等。2006年，王印庚等对养殖刺参保苗期的腐皮综合征发病幼参进行了详细的病原学分析，发现假交替单胞菌属细菌和另外一种弧菌属细菌是优势菌。同年，张春云等从患腐皮综合征刺参的病灶部位分离得到灿烂弧菌K1T,经人工回感染试验，发现该优势菌株引发刺参发病的症状与自然发病刺参的症状相同，其对健康刺参有较强致病和致死作用，并从人工感染发病的刺参个体内分离到大量形态单一的菌株，其形态特征和生化特征与K1-I菌株

8、完全相符，表明灿烂弧菌是刺参腐皮综合征的主要致病菌。从自然发病的幼参病灶部位还分离到一种优势菌FP-I,经人工回接感染试验证实该细菌对健康幼参有致病作用，腹腔注射FPT,能引起受试刺参半数死亡，且发病刺参出现的症状与自然发病刺参的症状相同，回接感染后再分离得到的FP-3与FP-I为同一种细菌，符合“柯赫法则”；根据普通细菌学表型特征对FP-1进行鉴定，可初步认为细菌FPT为弧菌属细菌，但对其16SrDNA测序并结合系统发育树的分类学分析结果表明，FP-I为假单胞菌属细菌；进一步分析得知，假单胞菌属细菌具有许多与弧菌属细菌相同的生化特征，如革兰氏阴性杆菌、极生单鞭毛、氧化酶阳性和发酵葡萄糖不产气

9、等特征，综合这两种细菌鉴定方法所得的结果最终证明了FP-I为假单胞菌属细菌。由此可见，对刺参腐皮综合征病原的种属鉴定需要结合分子生物学和生理生化测定等多种方法。另外，芽泡杆菌属细菌也出现在患腐皮综合征刺参的肠道中，他们也被认为是导致腐皮综合征发生的重要致病菌之一。病毒亦是刺参腐皮综合征的重要病原种类。目前关于病毒引起的刺参病害报道较少，且研究不够深入，主要涉及刺参组织液或病变组织中病毒颗粒形态观察，未对病毒的核酸组成、感染机制和病毒分类进行深入研究。2005年，王品虹等用电镜负染技术检测表皮溃烂及黏液增多的刺参组织提取液，观察到大量具有囊膜近似球形样的病毒粒子，完整的病毒粒子直径为80100n

10、m,囊膜厚610nm,核心结构直径3545nm,呈六边形；应用超薄切片技术对刺参的触手臂、疣足、触手顶部、背肠血管、呼吸树和肠等组织的病毒感染状况进行观察，发现该种病毒粒子大量存在于所检测的各组织内；感染细胞的超微结构表现为大量细胞器崩解形成空泡结构，并出现“髓科样”结构等病理变化，根据观测结果，该病毒是一种无包涵体病毒。2008年，Deng等通过超薄切片的电镜观察，并从出现排脏和皮肤溃烂症刺参消化道、呼吸树的细胞胞浆中分离获得直径为75200nm的球形病毒颗粒，但在健康的刺参中检测不到病毒颗粒。将健康刺参暴露于含有病毒颗粒的培养基中，无论是否添加细菌悬浮液，其发病症状与可分离病毒的刺参相同，

11、且死亡率为90%100%；形态学观察表明，病毒形态各异，表明并不是一种病毒引起的病症，且与已报道的贝类病毒具有很大差异，然而遗憾的是并未对该病毒进行分类地位的确定。2010年，1iu等亦从患腐皮综合征的刺参中分离到具有双层囊膜、直径为100250nm的球形病毒粒子,提取该病毒的粗提物并感染健康刺参，刺参出现包括触须活动减少、背部乳头状足部衰减、肠壁周围肿胀和腹部溃疡等病症。2灿烂弧菌的致病机制刺参在发育过程中的各个阶段，均易被病原微生物感染，导致刺参疾病的发生。病原菌引起宿主感染的主要毒力因子包括蛋白酶、溶血素、In型分泌系统、黏附因子和铁摄取系统等，通过黏附、分泌胞外毒力因子和营养竞争等多个

12、过程，达到其在易感宿主中的入侵和定植。灿烂弧菌是导致刺参腐皮综合征发生的主要病原菌之一，目前的研究表明，灿烂弧菌的黏附因子和胞外产物等过程均与其毒力相关。2.1病原菌黏附黏附作用对病原菌的致病力有着至关重要的作用，其具有抵抗黏液冲刷、细胞纤毛运动和肠蠕动等过程的清除作用，有利于病原菌在宿主体表和体内定居。Dai等分别采用5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素5-(4,6-dich1orotriaziny1)aminof1uorescein,5DTAF)的化学标记法和绿色荧光蛋白(Greenf1uorescentPrOtein,GFP)的生物标记法，对灿烂弧菌进行了荧光标记，进而对标记菌在刺参体内

13、的分布进行了追踪(图2),结果表明，灿烂弧菌在感染初期可侵染到刺参的呼吸树、触手、肠道、肌肉和体腔液等各个组织中，随着感染时间延长至48h和96h,荧光标记的灿烂弧菌可在肠道和呼吸树中被检测到，而在其他组织中菌体的量极少。因此推断，呼吸树和肠道是灿烂弧菌感染刺参的主要组织器官。图2荧光显微镜下观察刺参呼吸树(A)、肠道(B)、体壁(C)、触手(D)和肌肉(E)中GFP标记的灿烂弧菌Fig.2F1uorescencemicroscopyofGFP-Iabe1edVibriosp1edidusinrespiratorytree(A),intestine(B),bodywa11(C),tentac1

14、e(D)andmusc1e(E)ofseacucumber弧菌的黏附因子一般可分为两大类：菌毛黏附素和非菌毛黏附素,前者包括鞭毛和纤毛等，后者包含脂多糖和外膜蛋白等。Dai等采用基因过表达技术研究了灿烂弧菌中F1iC(鞭毛蛋白亚基)是否参与菌体黏附，结果表明，/7基因过表达菌株的生物膜形成能力和运动能力均明显高于野生型菌株，且/7兀基因的过表达导致灿烂弧菌对刺参肌肉、呼吸树和肠道组织中的黏附效率增加，而对体壁和触手的黏附率无明显影响，因此，F1iC介导的黏附具有明显的组织特异性。除了使用F1iC聚合而成的鞭毛丝作为黏附因子，二氢脂酰胺脱氢酶(dihydroacry1amidedehydroge

15、nase,D1Ds)是目前已知的灿烂弧菌另一黏附因子。Dai等制备了D1D1和D1D2的多克隆抗体，并对菌体表面的D1D1和D1D2蛋白进行封闭，D1DkD1D2抗体封闭后的菌体对刺参体腔细胞的黏附率分别为7.5%、12.5%,均显著低于野生型菌株的黏附率25%,封闭后的菌体对刺参各组织的黏附率亦均有所下降，对肠组织的黏附更具有特异性。2.2灿烂弧菌的致病因子2.2.1金属蛋白酶VSn1金属蛋白酶是多种病原菌中公认的重要致病因子。灿烂弧菌中的PS勿基因(VS_RS05940)编码金属蛋白酶，是灿烂弧菌中第一个被鉴定的胞外毒力因子。研究者分别向同等刺参体腔细胞中加入70、90、100U1纯化的重

16、组VSm蛋白(50mmo11),发现加入不同量Vsm蛋白后的细胞存活率约下降至对照组的86%、79%和72%,表明灿烂弧菌的VSm对刺参体腔细胞具有明显的细胞毒性。2.2.2铁离子吸收铁是宿主和病原微生物必需的营养素。铁离子的氧化还原电位是导致铁离子产生生物毒性的主要原因，因此，细胞内铁离子的浓度和分布受到严格的控制。考虑到几乎所有病原微生物对铁的绝对需求，宿主通过限制入侵病原微生物的生物可利用性铁成为宿主先天免疫系统的重要组成部分。病原微生物在宿主体内夺取铁离子的能力及对铁离子的利用，已经成为多种病原微生物致病过程的重要组成部分。研究者从铜绿假单胞菌培养物中经过C1r的亲和层析获得了对Fu具有高亲和力的荧光铁载体pyoverdine,体外抑制试验表明，Pyoverdine(1001,50mmo11)可显著抑制灿烂弧菌在2216E培养基中的生长；采用pyoverdine对刺参养殖海水进行预处理，